可誘導表達hBMP-2基因的慢病毒載體的構建及其慢病毒的產生和鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的：構建可誘導表達人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(hBMP-2)基因的慢病毒載體，轉染人胚胎腎上皮細胞系293FT細胞獲得相應的病毒顆粒，感染并獲得在強力霉素誘導條件下高效表達hBMP-2的人臍帶間充質干細胞，為下一步可誘導表達hBMP-2的人臍帶間充質干細胞移植治療骨壞死奠定堅實的實驗基礎。
　　 方法：以pcDNA-hBMP-2為模板，采用聚合酶鏈反應法擴增前后端帶有attB重組位點的入骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(hBMP-2)全長序列。利

2、用Gateway載體構建技術，將擴增產物通過BP反應克隆至pDown載體中，測序正確后，采用LR重組酶將pDownhBMP-2，pUp-TRE和pLV/Des2-Neo進行重組反應，構建慢病毒載體表達質粒pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2。將pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2與包裝質粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5)混合，利用脂質體共同轉染293FT

3、細胞，包裝攜帶hBMP-2基因的慢病毒顆粒，感染人臍帶間充質干細胞，在強力霉素(doxcycline)誘導下，用ELISA檢測目的細胞hBMP-2的表達情況。
　　 結果：通過酶切、聚合酶鏈式反應及測序驗證可誘導hBMP-2真核表達慢病毒載體構建成功；pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2與包裝質粒共轉染包裝細胞293FT細胞，成功獲得攜帶hBMP-2基因的慢病毒顆粒，繼之感染人臍帶間充質干細胞，在強力霉素誘導條件下，

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