菲律賓蛤仔I型溶菌酶基因克隆、表達(dá)及抗菌活性分析.pdf

1、菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）是我國(guó)重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類(lèi)，主要依賴(lài)非特異性免疫系統(tǒng)進(jìn)行免疫防御。溶菌酶作為一種重要的免疫效應(yīng)因子，在機(jī)體免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。溶菌酶具有生物多樣性，在動(dòng)物界中存在C型（chicken type lysozyme，C-type）、G型（goose type lysozyme，G-type）和I型（invertebrate type lysozyme，I-type）三大類(lèi)

2、型。
　　本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)室已有的EST序列，運(yùn)用RACE技術(shù)，從菲律賓蛤仔體內(nèi)克隆獲得I型溶菌酶（RpiLYZ-2）基因全長(zhǎng)cDNA序列。分析結(jié)果顯示：其cDNA全長(zhǎng)為709 bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）包括471 bp，編碼156個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為17.78 kDa，理論等電點(diǎn)為8.16，含有信號(hào)肽序列，其長(zhǎng)度為16個(gè)氨基酸；具有完整的失穩(wěn)酶結(jié)構(gòu)域（Leu25-Tyr150）。熒光定量結(jié)果分析表明，該基因在外套膜組織中表達(dá)量最

3、高，在肌肉組織中表達(dá)量最低。對(duì) RpiLYZ-1（本實(shí)驗(yàn)室克隆獲得）和 RpiLYZ-2進(jìn)行了同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建分析，結(jié)果表明：RpiLYZ-1和RpiLYZ-2的同源性較低，相似度只有37％左右；RpiLYZ-1與雙殼貝類(lèi)I型溶菌酶的親緣關(guān)系較近，而RpiLYZ-2與黑腹果蠅的I型溶菌酶親緣關(guān)系較近，說(shuō)明RpiLYZ-1和RpiLYZ-2屬于兩種不同亞型的I型溶菌酶。
　　本研究運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)，探討了環(huán)境因子改變對(duì)菲律賓

4、蛤仔兩種I亞型溶菌酶基因表達(dá)的影響。分別在溫度（13℃、21℃、29℃）和鹽度（12、22、32）下刺激菲律賓蛤仔7 d，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)RpiLYZ-1和RpiLYZ-2基因表達(dá)量的變化情況。結(jié)果表明：在不同溫度和鹽度刺激下，RpiLYZ-1基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)大體為先上升后下降，RpiLYZ-2基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)大體為先下降后上升，但高溫和低鹽刺激均能影響菲律賓蛤仔溶菌酶基因的表達(dá)。鰻弧菌刺激菲律賓蛤仔72 h，RpiLY

5、Z-1基因表達(dá)變化趨勢(shì)為先上升后下降再上升，RpiLYZ-2基因表達(dá)變化趨勢(shì)為先下降后上升。根據(jù)RpiLYZ-1和RpiLYZ-2基因表達(dá)變化趨勢(shì)推測(cè)兩種亞型溶菌酶可能存在功能分化。
　　在體外構(gòu)建重組蛋白表達(dá)載體 RpiLYZ-1-pEASY-E1和 RpiLYZ-2-pET-21a(+)，然后利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，在IPTG誘導(dǎo)作用下大量表達(dá)兩種重組蛋白。再通過(guò)鎳瓊脂糖凝膠色譜法純化目的蛋白，利用梯度稀釋法復(fù)性目的蛋白，為檢測(cè)

6、重組蛋白的生物學(xué)活性提供原料。
　　利用比濁法檢測(cè) RpiLYZ重組蛋白的相關(guān)活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：重組蛋白R(shí)piLYZ最適pH為3.5和5，重組蛋白R(shí)piLYZ-1最適溫度為20℃，而重組蛋白R(shí)piLYZ-2最適溫度為10℃。重組蛋白R(shí)piLYZ具有廣譜的抗菌性，對(duì)真菌、革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均具有一定抑菌能力。以陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、鰻弧菌、藤黃微球菌分別為底物，發(fā)現(xiàn)重組蛋白R(shí)piLYZ-1和RpiLYZ-2對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌

7、和革蘭氏陰性菌均具有溶菌活性。以肽聚糖為反應(yīng)底物測(cè)定重組蛋白R(shí)piLYZ-1和RpiLYZ-2的胞壁酸酶活性，發(fā)現(xiàn)重組蛋白R(shí)piLYZ能夠水解細(xì)菌的細(xì)胞壁。熱處理重組蛋白R(shí)piLYZ-1和RpiLYZ-2對(duì)溶壁微球菌不具有非酶抑菌活性，但對(duì)鰻弧菌和陰溝腸桿菌具有非酶抑菌活性。
　　菲律賓蛤仔血細(xì)胞具有吞噬作用，能夠吞噬藤黃微球菌和燦爛弧菌。加入重組蛋白R(shí)piLYZ-1（濃度約4μM）后，血細(xì)胞對(duì)藤黃微球菌和燦爛弧菌的吞噬能力分別增

8、加了20%和8%；加入重組蛋白R(shí)piLYZ-2（濃度約4μM）后，血細(xì)胞對(duì)藤黃微球菌和燦爛弧菌的吞噬能力分別增加了14%和9%，說(shuō)明重組蛋白R(shí)piLYZs能夠在體外促進(jìn)血細(xì)胞的吞噬活性，具有免疫調(diào)理功能。
　　綜上所述，從菲律賓蛤仔中克隆獲得不同亞型的I型溶菌酶在其免疫防御上發(fā)揮重要作用。當(dāng)環(huán)境因子發(fā)生變化時(shí)，菲律賓蛤仔會(huì)調(diào)節(jié)體內(nèi)I型溶菌酶的表達(dá)量來(lái)進(jìn)行免疫防御。生物學(xué)活性研究結(jié)果顯示，重組蛋白 RpiLYZ-1和RpiLYZ-2