大鼠肝抗菌肽基因的克隆、表達(dá)及活性分析.pdf

1、肝臟是哺乳動(dòng)物體內(nèi)再生能力極強(qiáng)的器官。肝再生是一個(gè)網(wǎng)絡(luò)化、受精細(xì)調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，涉及到大量的功能基因和蛋白質(zhì)。本文通過(guò)利用抑制性消減雜交技術(shù)和基因芯片相結(jié)合，尋找肝再生中的差異表達(dá)基因，并且克隆和分析與肝再生有關(guān)的基因(肝抗菌肽)及其在大鼠肝再生中的動(dòng)態(tài)變化，以探尋它對(duì)肝再生的作用，為研究肝再生分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。方法：提取大鼠SISPH肝再生材料的總RNA，用抑制性削減雜交技術(shù)篩選出與肝再生有關(guān)的基因(EST)；把這些EST制成大鼠肝再

2、生表達(dá)譜基因芯片；利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)并克隆與肝再生有關(guān)的肝抗菌肽基因；利用原核表達(dá)技術(shù)表達(dá)和純化出肝抗菌肽；用RT-PCR進(jìn)一步對(duì)肝抗菌肽基因mRNA在大鼠SISPH的變化動(dòng)態(tài)進(jìn)行檢測(cè)；利用生物信息學(xué)對(duì)肝抗菌肽基因和蛋白進(jìn)行分析，并對(duì)其抗菌活性和肝再生中的功能作出預(yù)測(cè)。結(jié)果：通過(guò)大鼠SISPH表達(dá)譜基因芯片，檢測(cè)出216個(gè)在肝再生中有差異表達(dá)的基因，其中131個(gè)為差異性顯著的基因；克隆出與肝再生相關(guān)的肝抗菌肽基因；生物信

3、息學(xué)分析結(jié)果為，大鼠肝抗菌肽前體由255個(gè)堿基組成，其成熟肽基因由63個(gè)堿基組成，定位于1q21。經(jīng)原核表達(dá)后，肝抗菌肽前體的融合蛋白表現(xiàn)為不溶性，而肝抗菌肽成熟肽的融合蛋白則表現(xiàn)為可溶性，肝抗菌肽前體由84個(gè)氨基酸組成，1-24個(gè)氨基酸為信號(hào)肽區(qū)，25-64個(gè)氨基酸為前區(qū)，65-84個(gè)氨基酸則為成熟肽。肝抗菌肽成熟肽中含有8個(gè)Cys，它在不同物種中具有高度的保守性，為發(fā)卡狀的空間結(jié)構(gòu)。結(jié)論：與大鼠肝再生有關(guān)的基因通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)等途徑在肝