聯(lián)合基因治療骨關節(jié)炎-IL-1Ra聯(lián)合自殺基因HSV-TK體內轉染治療兔膝骨性關節(jié)炎的實驗研究.pdf

1、研究目的：
　　 骨性關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是老年人群發(fā)病率較高的疾病之一，是在全身因素和局部因素的綜合作用下，關節(jié)軟骨發(fā)生生化、結構和代謝改變，最終出現(xiàn)關節(jié)軟骨軟化、破潰和局部剝脫以及關節(jié)邊緣骨與軟骨贅生物形成等病理改變，臨床上可產(chǎn)生關節(jié)疼痛、活動受限和關節(jié)畸形等癥狀，嚴重影響老年人的身體健康，是致殘的重要原因。在骨關節(jié)炎的病理改變中，大量炎性介質的產(chǎn)生和釋放是造成局部關節(jié)改變的重要因素。其中IL-1和T

2、NF-a是OA病理過程中促進軟骨基質降解和關節(jié)軟骨破壞的兩種最重要的細胞因子，其他細胞因子對關節(jié)軟骨的破壞往往是間接通過IL-1和TNF-a發(fā)揮作用。目前國內外對OA的發(fā)病機制和治療研究很多，但療效不盡如人意，近些年來自殺基因治療為骨關節(jié)炎的治療提供了一種新的方法。本實驗中，我們應用基因治療的方法，利用重組重組腺相關病毒載體(rAAV)，將外源性抑炎性因子基因聯(lián)合自殺基因直接體內轉染兔膝關節(jié)后，觀察對骨關節(jié)炎的治療效果。有可能在骨關節(jié)炎

3、的治療上去的新的進展。
　　 方法：
　　 采用切斷并切除前交叉韌帶及內側半月板的方法將32只新西蘭白兔的右后膝關節(jié)制成OA的動物模型，將兔子平均分成四組，將有rAAV包裝的目的基因通過髕韌帶注射入關節(jié)腔內，A組rAAV2/1-IL-1Ra1ml，B組rAAV2/1-HSV-tk1ml，C組rAAV2/1-TK--IL-1Ra1ml，D組為對照組，轉染含空質粒的rAAV2/11ml。關節(jié)腔內注射24小時后，每只動物給予靜

4、脈內注射更昔洛韋(GCV)5mg/天，一天兩次，持續(xù)三天。注射后第7天，用1ml生理鹽水灌洗關節(jié)腔，抽取關節(jié)腔灌洗液用ELISA分析外源基因的表達情況，注射后第14天，處死動物，用無菌生理鹽水1ml灌洗關節(jié)腔，抽取關節(jié)罐洗液進行IL-1Ra、IL-1β、TNF--a及TGF-β1的ELISA分析，取滑膜組織通過rea1-timePCR方法檢測目的基因的表達，并用相對定量的方法—2-△△CT進行目的基因表達的分析，目的基因包括:IL-1β

5、、TNF-α、及TGF-β1。取關節(jié)標本進行固定，包埋，切片和HE染色及番紅O染色，鏡下觀察軟骨細胞排列情況，并進行軟骨組織學評分。
　　 結果：
　　 通過ELISA檢測分析接受IL-1Ra基因治療的A組及IL-1Ra聯(lián)合HSV-tk基因治療的C組在外源基因注射后第7天和第14天，關節(jié)液內有穩(wěn)定的外源基因IL-1Ra的表達，而轉染HSV-tk基因的B組及未有基因轉染的對照組D組未檢測到人IL-1Ra的表達。說明外源基因

6、能在關節(jié)腔內表達。
　　 通過real-timePCR檢測目的基因的表達量，IL-1β的表達量三個實驗組明顯低于對照組，此外C組即IL-1Ra聯(lián)合HSV-tk基因治療組明顯低于A組IL-1Ra基因治療組和B組HSV-tk基因治療組，差別有統(tǒng)計學意義;TNF-α的表達量對照組高于三個實驗組，聯(lián)合基因治療組低于單基因治療組，差別有統(tǒng)計學意義;TGF-β1的表達量對照組明顯高于三個實驗組。
　　 通過ELISA檢測，IL-1β

7、在A組、B組、C組的水平明顯低于對照組D組，TNF-α的表達水平在對照組明顯高于三個治療組，差別有統(tǒng)計學意義;TGF-β1水平對照組明顯高于導入外源性基因的A、B、C三組，統(tǒng)計結果以平均值±SEM表示，n=3，P＜0.05。
　　 HE染色及番紅O示染色未轉染基因的對照組關節(jié)軟骨表面粗糙并有軟骨剝脫，外源性基因導入后，軟骨損害及軟骨基質降解明顯減輕。關節(jié)軟骨的Mankin's評分顯示對照組的評分8.264±-0.044明顯高于三

8、個基因治療組，而聯(lián)合基因治療組的評分明顯低于兩組單一基因治療組。
　　 結論：
　　 我們將攜帶目的基因的重組腺相關病毒載體注射入關節(jié)腔內，進行體內轉染試驗，使其在體內表達相應的目的基因。根據(jù)實驗結果我們發(fā)現(xiàn)，IL-1Ra因聯(lián)合自殺基因HSV-tk對于骨關節(jié)炎的基因治療優(yōu)于單純的使用IL-1Ra基因或HSV-tk基因治療，不僅可以有效地減少豐要促炎性因子——IL-1β的含量，減輕滑膜炎癥，同時還可以減輕軟骨損害和軟骨基質