大豆高效整個子葉節(jié)再生體系的建立及根癌農桿菌介導的雙價抗蟲基因在大豆上的轉化.pdf

1、大豆是世界上重要的油料作物以及植物蛋白來源之一，因此大豆基因工程育種具有重要的意義。實驗采用一種新的技術方法即大豆整個子葉節(jié)為外植體，利用直接芽再生方式建立了一種新的快速有效的再生體系，并在此平臺上用雙價抗蟲基因對大豆進行了遺傳轉化。 成熟大豆種子消毒后在添加BA0.4mgL-1的MSB5培養(yǎng)基中培養(yǎng)了5～7d得到無菌苗，切取整個子葉節(jié)外植體，將外植體轉入不同芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d后，轉入MSB5培養(yǎng)基上進行芽伸長培養(yǎng)，至芽伸

2、長到3～4cm，轉至含有IBA0.5mgL-1的MSB5培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，煉苗并移栽到溫室得到可育植株。實驗中，對芽的形態(tài)發(fā)生過程以及細胞內淀粉和蛋白質含量的相對變化進行了觀察分析，發(fā)現(xiàn)分生細胞內蛋白質含量隨著芽發(fā)育的不同階段呈周期性變化；研究了BA或CPPU對大豆整個子葉節(jié)芽誘導的作用，確定了BA在整個子葉節(jié)芽誘導過程中效果好于CPPU；利用正交設計方法對三種植物激素以及大豆基因型對芽誘導的影響進行研究，結果表明，BA、KT、IB

3、A對芽誘導效果都有極顯著影響，其中BA的影響最大，大豆品種合豐25在MSB5+BA3.0mgL-1+IBA0.2mgL-1+KT0.5mgL-1的培養(yǎng)基中誘導出芽效果最好，每個外植體可以得到30～35個芽，并且大部分芽都可以伸長并生根。為了驗證新建立的再生體系的效果，將此再生體系與傳統(tǒng)的大豆子葉節(jié)再生體系、近幾年應用較多的大豆胚尖再生體系在再生頻率、出芽數(shù)目、芽伸長情況以及再生周期等方面進行研究比較，結果表明，大豆整個子葉節(jié)再生體系在外

4、植體再生頻率以及出芽數(shù)量上優(yōu)于其它兩種體系。 本實驗嘗試采用大豆整個子葉節(jié)為外植體建立了一種快速有效的再生體系，與子葉節(jié)、胚尖再生體系相比較，提高了再生效率和不定芽的數(shù)量，減小了品種特異性對大豆再生體系的影響，并且大大縮短了再生周期。研究結果表明，使用這個再生平臺，再生效率達到95％以上，可以在60天內獲得大量的再生小苗。 利用根癌農桿菌介導的轉化方法對三個大豆品種的整個子葉節(jié)外植體進行雙價抗蟲基因的遺傳轉化，并對轉化體

5、系中幾個因素進行優(yōu)化，建立了基于整個子葉節(jié)再生平臺的大豆遺傳轉化體系。結果表明，不同農桿菌菌株對大豆的轉化效率不同，EHA105的轉化效率高于LBA4404和GV3101；不同大豆品種對農桿菌浸染的敏感性存在差異，其中合豐48的效果較好；轉化過程中采用Cef300mgL-1+Cb200mgL-1和PPT5.0mgL-1進行除菌和篩選，效果較好。應用這個轉化體系，轉化頻率在5.50％～12.07％之間。經過分子驗證以及抗除草劑、抗蚜蟲實驗