小鼠CD19胞外區(qū)基因和人組蛋白HleC端基因的克隆及其原核表達.pdf

1、CD19分子是B淋巴細胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是B淋巴細胞表面重要標志之一。CD19是CD19/CD21/CD81信號復合體中一個成分，信號復合體可調節(jié)BCR刺激活化的閾值，其中CD21(CR2)結合BCR上的補體C3片段，使CD19與BCR交聯(lián)，促進B細胞激活，這種作用對于B細胞初次應答尤為重要<'[1～3]>。CD19胞膜外區(qū)參與了與CD21和CD81的相互作用，CD19的跨膜區(qū)也參加了與CD21和CD81的相互作用。CD19胞漿

2、區(qū)可與PI-3K，Vav以及Src家族中Lyn，Fyn激酶相結合<'[4～7]>。 首先根據GenBank登錄的小鼠CD19基因序列<'[8]>設計一對引物，通過反轉錄-聚合酶鏈式反應(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技術，從小鼠脾臟組織總RNA中擴增出一條特異性基因片段，經單酶切鑒定，與GenBank中登錄的小鼠CD19基因序列含有相同的單酶切位點。

3、PCR產物分離純化后連接到pGEX-4T-1載體，經菌液PCR篩選出陽性重組克隆后進行序列測定。結果表明本實驗成功的克隆到CD19基因的胞膜外區(qū)片段，由918個核苷酸組成，編碼306個氨基酸。所克隆的小鼠MECD19基因與GenBank中登錄的小鼠CD19基因<'[14]>相比較，有6個核苷酸的差異，同源性為99.7％。 其次，將原核表達重組質粒pGEX-4T-1-MECD19轉化到大腸桿菌BL21，經37℃和1.0mmol/L

4、 IPTG的誘導，SDS-PAGE凝膠電泳表明所克隆的基因片段在大腸桿菌中得到融合表達，表達出谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)與MECD19的融合蛋白GST-MECD19，且表達的產物主要以包涵體的形式存在。所獲得的融合蛋白分子量分別約為59 KD，與預期結果相符。 最后，通過優(yōu)化原核表達條件，確定了原核表達重組質粒pGEX-4T-1-MECD19的最佳誘導時間和誘導劑濃度后，對含有pGEX-4T-1-MECD19質粒的BL21菌

5、進行了大量誘導表達，實驗中使用反復凍融和超聲方法來裂解誘導表達菌，獲得了較高濃度的GST-MECD19包涵體蛋白，用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法使包涵體充分溶解，提取了大量的可溶性GST-MECD19原核融合表達蛋白。 綜上所述，本研究成功地克隆了小鼠CD19基因的胞外區(qū)片段，并進行了原核表達，獲得了大量的GST-MECD19原核融合表達蛋白，這些都為進一步研究小鼠CD19分子免疫學功能及其應用提供了試驗材料。 表達組

6、蛋白是真核生物染色體(質)中含量最高的結構蛋白，其總量與染色體DNA大致相等。組蛋白屬于堿性蛋白質，等電點一般在pH10.0以上，能與帶有負電荷的DNA分子緊密結合。按組成中精/賴氨酸的比例，組蛋白可被分為五種：H1、H2A、H2B、H3、H4。H1組蛋白由220個氨基酸組成，分子量較大，進化中不如其它組蛋白那么保守，哺乳類細胞的組蛋白H1約有8種密切相關的，氨基酸系列上稍有不同的亞型，H1組蛋白在構成核小體時起連接作用，可賦予染色質以

7、極性，與核小體包裝成更高一級結構的過程相關<'[1～4]>。 首先根據GenBank登錄的人組蛋白Histl Hle基因序列<'[5]>設計一對引物，先通過提取人基因組DNA，再利用PCR技術，從人基因組DNA中擴增出一條特異性基因片段。PCR產物分離純化后連接到pET-32a載體，經菌液PCR篩選出陽性重組克隆后進行序列測定。結果表明本實驗成功的克隆到人組蛋白Hle基因的C末端區(qū)域，由435個核苷酸組成，編碼145個氨基酸。所

8、克隆的人組蛋白Hle C基因與GenBank中登錄的人組蛋白Hle基因相比較，同源性為100％。 其次，將原核表達重組質粒pET-32a-Hle C轉化到大腸桿菌BL21，經37℃和1.0mmol/L IPTG的誘導，SDS-PAGE凝膠電泳表明所克隆的基因片段在大腸桿菌中得到融合表達，表達出含有His Tag與人組蛋白Hle基因的融合蛋白His-Hle C，且表達產物主要以包涵體的形式存在。所獲得的融合蛋白His-Hle C分

9、子量約為36 KD，與預期結果相符。 最后，通過優(yōu)化原核表達條件，確定了原核表達重組質粒pET-32a-Hle C的最佳誘導時間和誘導劑濃度后，對含有pET-32a-Hle C質粒的BL21菌進行了大量誘導表達，實驗中使用反復凍融和超聲方法來裂解誘導表達菌，獲得了較高濃度的His-HleC包涵體蛋白，用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法使包涵體充分溶解，提取了大量的可溶性His-Hle C原核融合表達蛋白。 綜上所述，本研究