基于轉錄組學的Streptococcus thermophilus TF96中心碳代謝機制的研究.pdf

1、我國是乳制品消費大國，截止2015年底，我國酸奶市場銷售額就已經突破800億元人民幣，并以每年較高的增長速度快速增長。嗜熱鏈球菌是常用的發(fā)酵菌株，市場份額巨大。然而工業(yè)化生產所需的發(fā)酵劑基本依賴于歐美發(fā)達國家企業(yè)。嗜熱鏈球菌細胞內代謝機制，尤其是碳水化合物代謝的研究，對優(yōu)化高密度培養(yǎng)基的組成及發(fā)酵過程參數的優(yōu)化，以獲得高品質的生產發(fā)酵劑具有重要作用。本論文以嗜熱鏈球菌為研究對象，在化學合成培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，利用轉錄組學和代謝組學技術

2、研究S.thermophilus TF96在控制pH的批次發(fā)酵過程中碳水化合物代謝路徑中關鍵基因的轉錄水平變化及胞內和胞外碳水化合物代謝概況與代謝產物變化，從碳水化合物代謝路徑關鍵基因轉錄水平和代謝產物層面揭示嗜熱鏈球菌碳水化合物代謝及調控機制，為后續(xù)高密度培養(yǎng)奠定理論基礎。本試驗共對遲滯期末期(T1)、對數期中期(T2)、對數期末期(T3)和穩(wěn)定期(T4)四個時期的嗜熱鏈球菌細胞樣本的RNA進行de novo測序。對過濾后的reads

3、進行組裝，總共組裝得到2255個Unigene和Contig，平均長度1119nt，N50達到2231nt，中位數長度達到1119nt。對組裝得到的進行長度統計發(fā)現超過45％的序列長度不超過500nt。
　　本研究主要內容包括：⑴對經過處理獲得的總Unigene進行注釋，其中有1470個基因注釋到KEGG數據庫中。通過分析，注釋到15個碳水化合物化合物代謝途徑中的基因共有260個。在S.thermophilusTF96增殖培養(yǎng)過程

4、中共有166個差異表達基因跟碳水化合物代謝有關。碳水化合物轉運是控制菌體生長的關鍵因素。本試驗菌體中編碼乳糖(lacS)、果糖(fruB）、甘露糖(manX/Y)和麥芽糖(malX)等碳水化合物轉運的基因都發(fā)生了差異表達。從總體上看，編碼PTS系統的基因在培養(yǎng)過程中表達量處于波動狀態(tài)，T1和T3是磷酸轉移酶系統基因表達高峰。其中PtsⅠ是磷酸轉移酶系統中關鍵基因，PtsⅠ表達量經歷不斷下調之后，當菌體到達穩(wěn)定期時顯著上調1.53倍。la

5、cS是編碼乳糖轉運的基因，lacS表達量在T2時顯著下調1.8倍，隨后當菌體處于T3時基因轉錄水平又顯著上調，說明遲滯期末期和對數期末期是乳糖轉運的高峰。受到培養(yǎng)基中乳糖濃度的限制，催化乳糖分解生成葡萄糖和半乳糖的基因lacZ在T4時顯著下調超過2倍。半乳糖激酶是嗜熱鏈球菌細胞中代謝半乳糖的關鍵蛋白酶，編碼該酶的基因galK表達水平在穩(wěn)定期之前一直處于上調狀態(tài)，T3時的表達量與T1相比上調了1.77倍，當嗜熱鏈球菌到達T4時與T3相比g

6、alK表達量顯著下調了2.78倍。從轉錄水平來看，S.thermophilus TF96在增殖培養(yǎng)過程中可能具有代謝半乳糖的能力。⑵糖酵解途徑是細胞中重要的產能途徑。本試驗中編碼葡糖激酶基因glk、葡萄糖-6-磷酸異構酶基因pgi、果糖-二磷酸醛縮酶基因fbaA、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因gapA、2，3-二磷酸甘油酸變位酶基因gpmA、丙酮酸激酶基因pyk和碳水化合物分解代謝蛋白基因CcpA等糖酵解途徑基因在增殖培養(yǎng)過程中均發(fā)生了差異表

7、達。glk和pyk是糖酵解途徑關鍵基因，其表達量在整個生長過程中都處于下調狀態(tài)，T2時下調的最為顯著。遲滯期末期可能是S.thermophilus TF96糖代謝比較活躍的時期。此外，遲滯期末期也是pfl、adhE和ackA基因表達高峰，當S.thermophilus TF96到達T2時這些基因全都顯著下降，分別下調了3.44倍、5.57倍、1.79倍和2.76倍，并在此后的培養(yǎng)階段一直都處于低表達狀態(tài)。丙酮酸氧化酶基因E1.2.3.3

8、在T2時顯著上調1.96倍，丙酮酸氧化酶基因的高表達使得菌體內形成乙酰磷酸化池，為指數期轉化為乙酸和提供ATP做好準備。試驗結果表明，乳酸是丙酮酸最主要的代謝產物，S.thermophilus TF96從T1開始，編碼乳酸脫氫酶的基因表達量逐漸增加。對不同時間段丙酮酸代謝相關基因表達水平進行分析發(fā)現，當菌體生長到T4時，由丙酮酸參與脂肪酸合成的代謝通路相關基因的轉錄水平增加。⑶從轉錄組水平共檢測到118個基因與細胞膜/壁的生物合成有關，

9、其中差異表達基因共有49個。在S.thermophilus TF96控制pH的批次發(fā)酵過程中，遲滯期是嗜熱鏈球菌有關細胞壁和細胞膜基因大量表達的階段，當S.thermophilus TF96生長進入對數期時，大部分基因表達量開始顯著下調。編碼轉位酶的基因也是肽聚糖合成的關鍵基因FtsW，基因FtsW表達量在T2時顯著上調了1.6倍，隨后當菌體處于T4時表達量顯著下調了1.9倍。本試驗在轉錄組水平檢測到胞壁酸酶、酰胺酶和內肽酶與肽聚聚糖降

10、解相關的酶的基因的表達。不同肽聚糖水解酶基因在嗜熱鏈球菌增殖培養(yǎng)過程中，其基因表達變化具有很大差別。S.thermophilus TF96細胞中oatA基因在轉錄水平參與調控細胞膜對外界脅迫環(huán)境的應答，oatA基因轉錄水平隨著發(fā)酵時間的延長顯著下調，當菌體處于T3時，與T1相比其表達量顯著下調了1.3倍，研究表明oatA能夠抵御肽聚糖水解酶對細胞壁的水解。隨著培養(yǎng)的進行，oatA基因表達量逐漸降低，菌體自溶增加。⑷在S.thermoph

11、ilus TF96增殖培養(yǎng)的發(fā)酵液中檢測到乳酸、乙酸、乙醇和乙醛等小分子代謝化合物豐度發(fā)生變化。從T1開始乙醛、乙醇和乙酸胞外豐度顯著增加，從T3到T4，培養(yǎng)基中乙醛和乙酸豐度有所下調。細胞內乙醛和乙醇豐度在T1和T2時沒有明顯變化，但是乙醛的豐度在T3時顯著增加，隨后在T4時明顯下降至31.98±3.73，然而從T3到T4，乙醇的豐度顯著提高到13.25±5.83，乙酸在開始發(fā)酵階段隨著培養(yǎng)時間的延長豐度逐漸增加，從4915.26±7