生物醫(yī)藥中糖胺聚糖結構分析新方法研究.pdf

1、糖胺聚糖是一類廣泛存在于動物細胞表面和細胞間基質的線性多糖，是一種復雜的糖類大分子。一般通過共價鍵連接在核心蛋白上，以蛋白聚糖的形式存在。由于發(fā)現(xiàn)糖胺聚糖在黏液分泌過程中具有一定的粘性并具有潤滑功能，因此又被稱為粘多糖。各種不同組織中所含有的糖胺聚糖各不相同，可以通過結合或者調控等方式在生理及病理過程中與多種蛋白產生相互作用，包括趨化因子、細胞因子、生長因子、成型素、酶和粘附分子等相互作用。另外糖胺聚糖也被認為與許多重要疾病，如炎癥、腫

2、瘤等，有密切關系。除了作為生物體內重要的功能物質，糖胺聚糖也是一類重要的生物藥物，例如抗凝血藥物、抗血栓藥物、治療緩解關節(jié)炎的藥物等等。
　　肝素作為一種抗凝血藥物，被廣泛認為是一種具有重要生物功能和獨特化學性質的糖胺聚糖多糖。上世紀30年代首次發(fā)現(xiàn)肝素可以有效的防止手術后血栓的生成，繼而發(fā)現(xiàn)可以治療靜脈血栓、肺栓塞、深靜脈栓塞等。但是對肝素的使用也引起了一系列不良副反應，如出血并發(fā)癥或者肝素誘發(fā)的血小板減少等等。通過對這些并發(fā)癥

3、的研究，對凝血機理有了更好的了解，從而引出了對分級肝素——低分子肝素的開發(fā)，可以對化學結構和生物特性有更好的了解。低分子肝素的定義為硫酸化的糖胺聚糖鹽平均分子量在8000 Da以下，且至少有60％的分子量分布在8000 Da以下。低分子肝素是通過控制的化學法或者酶法降解使肝素分子量降低，且抗Xa因子的效價應大于70 unit/mg，抗Xa因子活性與抗Ⅱa因子活性的比值應大于等于1.5。目前低分子肝素的生產工藝有以下幾類，β-消除降解法、

4、亞硝酸降解法、酶降解法、過氧化物降解法。利用β-消除降解法生產的低分子肝素主要為依諾肝素鈉;利用亞硝酸降解法生產的低分子肝素主要品種根據(jù)分子量不同分別稱為達肝素鈉和那屈肝素鈣;利用酶降解法生產的低分子肝素主要為汀肝素鈉;利用過氧化物降解法生產的低分子肝素有帕肝素鈉。對每種低分子肝素各個國家都有明確的要求，包括平均分子量、分子量分布、抗Xa因子與抗Ⅱa因子的效價及其比值、末端結構、硫酸化程度等等。市場份額最高的三種低分子肝素為依諾肝素鈉、

5、達肝素鈉和那屈肝素鈣。在美國的肝素市場超過三億美元的份額當中，70％來自于依諾肝素鈉的銷售。除了肝素與低分子肝素，還有一類化學合成的超低分子肝素，主要有磺達肝癸鈉和艾卓肝素鈉。受瘋牛病、肝素污染事件等因素的影響，尋找新的肝素產品生產途徑一直是各國科學家努力的方向，使用化學合成法生產肝素產品是首選的代替途徑?；沁_肝癸鈉肝素寡糖藥物是基于肝素中與抗凝血酶Ⅲ相互結合的作用位點核心五糖的結構合成的最簡潔的肝素產品?；沁_肝癸鈉與肝素最大的區(qū)別即為

6、磺達肝癸鈉僅特異性的與抗Xa因子結合，并沒有藥用肝素的眾多重要的藥理學特性。另外磺達肝癸鈉的半衰期比肝素要更長，但是過量的抗凝血活性不能被魚精蛋白所中和。
　　糖胺聚糖通過結合或者調控的方式在各項生理功能和疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。對各種不同來源的糖胺聚糖的研究可以從分子水平上對功能和病理研究給予支持。對健康個體與疾病個體糖胺聚糖含量、種類、組成等方面的差異的研究有助于對生物標志物的探索，進而實現(xiàn)對疾病診斷的輔助作用，同時

7、對于新藥開發(fā)、藥物代謝動力學研究也有極大的幫助。因此對糖胺聚糖的提取、分離及純化技術的需求也日益強烈。較常見的糖胺聚糖樣品來源有各種生物組織、各類細胞以及各種體液。由于不同來源糖胺聚糖的存在形式各有差異，因此針對物理化學性質的差異，對于不同來源糖胺聚糖的提取、分離及純化技術的開發(fā)也有所不同。
　　隨著對糖胺聚糖生物功能和生物制藥等生物醫(yī)藥方面越來越深入的研究，對糖胺聚糖的分析技術提出了越來越高的要求。對生物樣本中糖胺聚糖的研究可以

8、為功能和疾病研究提供分子水平的信息支持，對糖胺聚糖藥物結構的表征對藥物安全性評估至關重要。如何提高分析的靈敏度和準確度，如何更好更深入的對糖胺聚糖結構進行表征是分析工作者面臨的一大挑戰(zhàn)。利用高效液相色譜法、毛細管電泳色譜法、凝膠電泳法、核磁共振波譜法以及質譜法可以實現(xiàn)對糖胺聚糖結構的表征。
　　本論文利用親水相互作用色譜、反相色譜與毛細管電泳色譜等分離技術在線串聯(lián)各種質譜實現(xiàn)了生物醫(yī)藥相關的糖胺聚糖類藥物以及生物樣本中提取的糖胺聚

9、糖的定性、定量分析。為糖胺聚糖類藥物結構確證提供了簡單可靠的分析方法，為生物樣品中糖胺聚糖的種類、含量、組成、健康與疾病個體差異等方面的研究提供了有效的技術手段，進而為尋找生物標志物以及新藥開發(fā)開拓了道路。本論文的主要研究成果如下:
　　1.建立了一種針對依諾肝素鈉結構確證的方法
　　我們采用酶法降解與化學法降解相結合的樣品處理方法將非還原端、還原端及骨架結構進行區(qū)分，并利用親水相互作用色譜串聯(lián)多反應監(jiān)測二級質譜技術對目前已

10、報道的依諾肝素鈉所有組成單元結構及部分新發(fā)現(xiàn)的結構進行了有效的分離并實現(xiàn)了全面的定性及相對定量分析。共鑒定到并定量了酶解產生的組成單元超過30種，包括天然存在及化學修飾后的各種肝素組成單元，及2個新結構;利用化學氧化及還原鑒定到11種末端結構。本方法經(jīng)過重復性評價，有較好的穩(wěn)定性及線性。在依諾肝素鈉注射液樣品分析中的應用表明本方法在LMWH相似性評價方面有著很高的應用價值。
　　2.建立了一種針對亞硝酸降解制備低分子肝素的結構確證

11、的方法
　　我們使用了一種麥芽糖修飾的親水相互作用色譜柱對復雜酸性二糖及寡糖的分離進行了優(yōu)化。使用高分辨串聯(lián)質譜共清晰的鑒定到亞硝酸降解制備的低分子肝素的36種基本組成單元。同時建立并驗證了多反應監(jiān)測二級質譜定量分析方法對達肝素鈉和那屈肝素鈣樣品進行了對比研究。鑒定并定量的每一部分組成單元都可以揭示這一類低分子肝素不同方面的特性，如具有抗凝血活性的功能區(qū)域、來源于原料肝素的結構、降解反應的切割位點以及由于副反應產生的經(jīng)過修飾的特殊

12、結構等。
　　3.介紹了一種新型串聯(lián)質譜Interface在低分子肝素藥物分析中的應用
　　介紹了一種電動泵毛細管電泳色譜串聯(lián)質譜方法，適用于分析糖胺聚糖寡糖，并使用了一種新型的interface實現(xiàn)了毛細管電泳色譜與質譜間的完美串聯(lián)。毛細管電泳色譜分離與電噴霧效果分別使用揮發(fā)性的電解質碳酸氫銨與含有甲醇/甲酸的鞘流液進行了優(yōu)化。實現(xiàn)了對肝素二糖到低分子肝素等各種高硫酸化的肝素寡糖的在線分析，且分析時間均在10分鐘左右，為高

13、通量分析提供了可能性。使用該方法，肝素糖鏈經(jīng)正向電泳分離后在線串聯(lián)正離子模式質譜分析，Bottom-up與Top-down兩種研究策略均有良好的重現(xiàn)性和較高的靈敏度。
　　4.建立了一種快速分析人尿液中糖胺聚糖成分的方法
　　通過對樣品回收率、酶解處理和二糖分析技術等進行優(yōu)化，建立了一種可以快速對人尿液中含量極低的糖胺聚糖進行定性定量分析的高效液相色譜串聯(lián)質譜的方法。本方法利用多反應監(jiān)測技術對經(jīng)過重組肝素酶和硫酸軟骨素酶降解

14、的尿樣中的糖胺聚糖進行研究。這一快速靈敏的方法實現(xiàn)了檢測尿樣中低水平的糖胺聚糖含量和二糖組成，可以檢測到比患有如粘多糖病等代謝疾病的患者尿樣中含量低10倍到100倍的糖胺聚糖成分。本方法可以檢測到正常人尿樣中含量極低(ng/mL)的糖胺聚糖，同時還可以檢測到炎癥、癌癥等疾病病人尿樣中糖胺聚糖含量和組成細微的差異。
　　5.建立了一套研究新來源糖胺聚糖藥物的提取及結構分析的方法
　　建立了一套提取雞蛋蛋清中硫酸角質素的方法及對

15、所提取到的硫酸角質素進行色譜串聯(lián)高分辨質譜分析的方法。我們使用商品化的雞蛋蛋清作為原料，提取硫酸角質素，并利用色譜串聯(lián)質譜、核磁共振波譜等技術進行結構鑒定，以開拓硫酸角質素的來源。對這種糖胺聚糖的研究對科學研究和藥物研發(fā)均有重要的意義。另外，本章節(jié)中介紹的方法為研究各種組織中糖胺聚糖的結構提供了研究思路。將化學降解、酶解等樣品處理方法和色譜、質譜、核磁共振波譜等分析技術相結合，可以對未知結構的、新來源的糖胺聚糖進行全面的結構表征，為功能