MiRNA及其合成通路相關(guān)基因在三疣梭子蟹性腺發(fā)育過(guò)程中的功能分析.pdf

1、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）廣泛分布于太平洋西部海岸的溫帶地區(qū)，是東亞各國(guó)重要的海洋漁業(yè)資源，也是中國(guó)重要的養(yǎng)殖對(duì)象。在過(guò)去的十年中，中國(guó)三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，2014年其總產(chǎn)量已達(dá)到118836噸。然而，由于三疣梭子蟹養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴(kuò)大以及繁殖調(diào)控技術(shù)的缺乏，優(yōu)質(zhì)的三疣梭子蟹的產(chǎn)量已不能滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的需求。繁殖調(diào)控技術(shù)的缺乏已經(jīng)成為制約該產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題。近年來(lái)，三疣梭子蟹的繁殖調(diào)控機(jī)制的

2、研究越來(lái)越受到人們的重視。性腺是生物體進(jìn)行有性生殖產(chǎn)生配子的主要器官，有眾多調(diào)節(jié)因子參與了配子發(fā)生過(guò)程的調(diào)控。目前，甲殼類(lèi)性腺發(fā)育和配子發(fā)生過(guò)程調(diào)控機(jī)制的研究主要集中在轉(zhuǎn)錄水平，轉(zhuǎn)錄后水平的研究較少。miRNAs作為一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，其在性腺發(fā)育過(guò)程的功能得到了廣泛的關(guān)注。本研究分析了三疣梭子蟹繁殖相關(guān)miRNA及其合成通路的重要基因在性腺發(fā)育過(guò)程的功能，主要研究結(jié)果如下：
　　1.MiRNA合成通路相關(guān)基因在三疣梭子蟹性

3、腺發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)分析
　　已知，Drosha、Exportin5、Dicer1和Argonaute1(AGO1)基因是miRNA合成通路的重要基因，而Dicer2和Argonaute2(AGO2)則主要參與siRNA的合成調(diào)控。為研究上述基因在三疣梭子蟹性腺發(fā)育過(guò)程中的功能作用，本實(shí)驗(yàn)利用RACE技術(shù)克隆了上述基因的cDNA全長(zhǎng)序列，同時(shí)進(jìn)行序列分析、同源分析和進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，Drosha、Dicer1和AGO1在進(jìn)化上高度保守

4、，與各自親緣關(guān)系較近的物種的蛋白質(zhì)序列相似度普遍較高（83％-99%），而Exportin5、Dicer2和AGO2則保守性較低（序列相似度44%-51%）。
　　對(duì)三疣梭子蟹Drosha、Exportin5、Dicer1、Dicer2、ADO1和ADO2基因進(jìn)行組織差異性表達(dá)分析，結(jié)果顯示上述基因在各種組織中均表達(dá)，且多種在肝胰腺或卵巢中高表達(dá)，其次為精巢等。對(duì)各基因在精巢發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，Drosha、Exporti

5、n5、Dicer1和AGO1基因的表達(dá)量均在II期達(dá)到最高，且各基因在不同時(shí)期表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致。Dicer2和AGO2均在I期高表達(dá)（P＜0.05），其他時(shí)期差異不大。在卵巢發(fā)育不同時(shí)期，Drosha與Exportin5基因在卵巢發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)量變化趨勢(shì)大致相同，都是隨著卵巢發(fā)育（從II期到 V期）逐漸升高，在V期達(dá)到最大值(P＜0.05)。Dicer1與AGO1在各時(shí)期表達(dá)量變化趨勢(shì)也基本一致，從I期到III期表達(dá)量變化不大，I

6、V期迅速上調(diào)，V期達(dá)到峰值，VI期又迅速下調(diào)。Dicer2與AGO2在各時(shí)期表達(dá)變化趨勢(shì)也基本一致，都是在II期和V期顯著高于其他時(shí)期(P＜0.05)。因此，我們推測(cè)Drosha、Exportin5、Dicer1、Dicer2、AGO1和AGO2基因均參與了三疣梭子蟹性腺發(fā)育的調(diào)控，同時(shí)暗示miRNAs和siRNA可能在相應(yīng)時(shí)期發(fā)揮重要作用。
　　2.三疣梭子蟹精巢和卵巢miRNA的鑒定與比較分析
　　為研究miRNAs在三

7、疣梭子蟹性腺發(fā)育過(guò)程中的功能作用，對(duì)三疣梭子蟹性腺相關(guān)miRNAs進(jìn)行鑒定和分析。利用Illumina測(cè)序技術(shù)，在卵巢和精巢中共識(shí)別了188個(gè)已知的和65個(gè)新的miRNAs。其中多個(gè)miRNA，如let-7、let-7c、let-7f，mir-2，mir-184和mir-276，在卵巢和精巢組織中均大量表達(dá)，暗示其在性腺發(fā)育和功能發(fā)揮過(guò)程中的重要作用。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，75個(gè)miRNA在卵巢和精巢之間差異表達(dá)。同時(shí)KEGG分析發(fā)現(xiàn)，這些mi