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文檔簡介
1、醋酸是常見的有機酸之一,其廣泛應用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。醋酸菌能氧化乙醇產醋酸,因為其較高的醋酸生產能力和醋酸耐受能力而常用于醋酸發(fā)酵生產。本論文主要圍繞巴氏醋桿菌AC2005的核酸修復酶UvrA與菌體醋酸耐受性之間的關系進行研究,利用基因工程的方法分別構建巴氏醋桿菌AC2005 uvrA基因敲除菌株和重組表達菌株,研究UvrA對菌體生長和醋酸發(fā)酵的影響,從而闡明UvrA與菌體醋酸耐受性之間的關系。研究將進一步完善醋酸菌醋酸耐受機制,并指導
2、醋酸菌發(fā)酵菌株的選育,具有一定的應用價值和科學意義。
醋酸對巴氏醋桿菌AC2005生長具有抑制作用,在1%的醋酸濃度條件下,AC2005的延滯期從1h增加到8h。利用瓊脂糖凝膠電泳分析基因組完整性,發(fā)現隨著醋酸濃度的增加AC2005基因組完整性下降;分析了不同醋酸濃度條件下巴氏醋桿菌AC2005蛋白表達情況,發(fā)現醋酸存在條件下其核酸修復相關蛋白表達量平均上調了54.8%。利用RT-PCR方法分析uvrA轉錄情況,發(fā)現菌體在1%
3、、2%醋酸濃度條件下,與對照相比,uvrA轉錄水平分別增加了146%和275%,說明醋酸會導致菌體基因組斷裂損失,此過程中醋酸菌會上調表達UvrA等核酸修復系統(tǒng)相關蛋白,UvrA可能與其醋酸耐受性相關。
利用自殺質粒pSUP202建立了巴氏醋桿菌AC2005基因敲除的方法,構建了巴氏醋桿菌uvrA基因敲除載體pSUP202-uvrA-1∷Km,利用同源重組的原理構建了巴氏醋桿菌AC2005 uvrA基因敲除菌株AC2005-Δ
4、uvrA;利用大腸桿菌和醋酸菌穿梭質粒pMV24構建uvrA基因重組表達質粒pMV24-uvrA,獲得UvrA重組表達菌株AC2005(pMV24-uvrA)和對照菌株AC2005(pMV24)。
在初始添加1%、2%和3%的醋酸條件下分析了醋酸對菌體生長的影響。與對照菌株AC2005(pMV24)相比,1%和2%醋酸條件下培養(yǎng)48h,AC2005-ΔuvrA的生物量分別下降了84.85%和47.13%,而AC2005(pMV
5、24-uvrA)的生物量分別提高了17.1%和24.2%;醋酸濃度3%條件下培養(yǎng)72 h,AC2005(pMV24)和AC2005-ΔuvrA生長受到顯著抑制,基本不生長,而AC2005(pMV24-uvrA)的生物量比對照提高了66.1%。分析了6%醋酸對菌體存活率的影響,6%的醋酸處理40 min,AC2005-ΔuvrA的存活率僅為2.56×10-5,而AC2005(pMV24-uvrA)的存活率是AC2005(pMV24)的大約
6、2倍。
利用含7%乙醇的醋酸發(fā)酵培養(yǎng)基比較了不同菌株的醋酸發(fā)酵情況,與對照AC2005(pMV24)相比,AC2005(pMV24-uvrA)的生長趨勢基本一致,但最終產酸量比對照菌株提高大約10%;而AC2005-ΔuvrA生長受到影響,發(fā)酵液中醋酸濃度達到0.45 g/100mL時其生物量和醋酸濃度開始下降。分析發(fā)酵過程乙醇脫氫酶(ADH)和乙醛脫氫酶(ALDH)活性發(fā)現,與對照相比,AC2005-ΔuvrA中ADH和AL
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