中國(guó)藥典-高效液相色譜剖析

1、中國(guó)藥典 高效液相色譜,,1,,定義,高效液相色譜法 系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對(duì)供試品進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。 注入的供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi),各組分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測(cè)器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號(hào)。,2,一、對(duì)儀器的一般要求和色譜條件,所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應(yīng)定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定,3,儀器包括： 儲(chǔ)液器

2、 泵 進(jìn)樣器 色譜柱 檢測(cè)器,色譜柱,反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統(tǒng)使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統(tǒng)使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對(duì)映異構(gòu)體的分離通常使用手性填充劑。,4,色譜柱,填充劑的性能（如載體的形

3、狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、含炭量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子量小于2000的化合物應(yīng)選擇孔徑在15nm以下的填料，分析分子量大于2000的化合物則應(yīng)選擇孔徑在30nm以上的填料。普通分析柱的填充劑粒徑一般在3~10µm之間。粒徑更?。s2µm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內(nèi)徑約2mm）。,5,注意,以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過(guò)40℃，

4、為改善分離效果可適當(dāng)提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過(guò)60℃流動(dòng)相的PH值應(yīng)控制在2~8的。當(dāng)PH大于8時(shí)，可使載體硅膠溶解；當(dāng)PH小于2時(shí)，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用PH值大于8的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化填充劑當(dāng)需使用PH值小于2的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基

5、硅烷鍵合硅膠填充劑,6,檢測(cè)器,最常用的檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，包括二極管陣列檢測(cè)器、其他常見(jiàn)的檢測(cè)器有熒光檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器等。紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器為選擇性檢測(cè)器，其響應(yīng)值不僅與供試品溶液的濃度有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；示差折光檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器為通用型檢測(cè)器，對(duì)所有的化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散檢測(cè)器對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與供試品的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測(cè)器可以

6、同時(shí)記錄供試品的吸收光譜，故可用于供試品的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。,7,檢測(cè)器,紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測(cè)器的響應(yīng)值與供試品溶液的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測(cè)器響應(yīng)值與供試品溶液的濃度通常呈指數(shù)關(guān)系，故進(jìn)行計(jì)算時(shí)，一般需經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。不同的檢測(cè)器，對(duì)流動(dòng)相的要求不同。如采用紫外檢測(cè)器，所用流動(dòng)相應(yīng)符合紫外—可見(jiàn)分光光度法（附錄V A）項(xiàng)下對(duì)溶劑的要求；采用低波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，還應(yīng)考慮有機(jī)相中有機(jī)溶劑的截止使用波長(zhǎng)，并

7、選用色譜級(jí)有機(jī)溶劑。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器通常不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動(dòng)相。,8,二極管陣列檢測(cè)器 （diode array detector，DAD）,特點(diǎn)：在任一時(shí)間內(nèi)，均可同時(shí)得到物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的吸收情況，即三維圖譜,多 組 分 混 合 物 的 三 維 圖 譜,,,,,流動(dòng)相,反相色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相首選甲醇-水系統(tǒng)（采用紫外末端波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，首選乙腈-水系統(tǒng)），如經(jīng)試用不適合時(shí)，再選用其他溶劑系統(tǒng)。應(yīng)盡可能少

8、用含有緩沖液的流動(dòng)相由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對(duì)于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例通常應(yīng)不低于5%，否則C18鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。,14,二、系統(tǒng)適用性試驗(yàn),色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通包括理論板數(shù)分離度重復(fù)性拖尾因子 分離度和重復(fù)性是尤為重要。,15,色譜柱的理論板數(shù)(n),用于評(píng)價(jià)色譜柱的分離效能。由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同，采

9、用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)，一般為待測(cè)組分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間tR（以分鐘或長(zhǎng)度計(jì)，下同，但應(yīng)取相同單位）和峰寬（W）或半高峰寬（Wh/2）,按n＝16（tR/w）2或n=5.54(tR/Wh/2) 2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。,16,分離度(R),用于評(píng)價(jià)待測(cè)組分與相鄰共存物或難分離物質(zhì)之間的分離

10、程度，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標(biāo)?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)定待測(cè)物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分離度，也可以通過(guò)測(cè)定待測(cè)組分與某一添加的指標(biāo)性成分（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)或其他難分離物質(zhì)）的分離度，或?qū)⒐┰嚻坊驅(qū)φ掌酚眠m當(dāng)?shù)姆椒ń到?，通過(guò)測(cè)定待測(cè)組分與某一降解產(chǎn)物的分離度，對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)與控制。,17,,無(wú)論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測(cè)峰與其他峰、內(nèi)標(biāo)峰或特定的雜質(zhì)對(duì)照峰之間有較好的分離度。除另外有規(guī)定外，待測(cè)組分與相鄰共存物之間的分離度應(yīng)大于1.5。分離度的計(jì)算公

11、式為： 2(tR2－tR1) 2(tR2－tR1)R＝─────── 或 R＝────────── W1＋W2 1.70（ W1，h/2＋W2,h/2）式中 t R2為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間；tR1為相鄰兩峰中

12、前一峰的保留時(shí)間；W1、W2及W1，h/2、W2,h/2分別為此相鄰兩峰的峰寬及半高峰寬。當(dāng)對(duì)測(cè)定結(jié)果有異議時(shí)，色譜柱的理論板數(shù)（n）和分離度（R）均以峰寬（W）的計(jì)算結(jié)果為準(zhǔn)。,18,重復(fù)性,用于評(píng)價(jià)連續(xù)進(jìn)樣中，色譜系統(tǒng)響應(yīng)值的重復(fù)性能。采用外標(biāo)法時(shí)，通常取各品種項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0％；采用內(nèi)標(biāo)法時(shí)，通常配制相當(dāng)于80％、100％和120％的對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量

13、的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進(jìn)樣2次，計(jì)算平均校正因子。其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差也應(yīng)不大于2.0％。,19,拖尾因子（T）,用于評(píng)價(jià)色譜峰的對(duì)稱性。為保證分離效果和測(cè)量精度，應(yīng)檢查待測(cè)峰的拖尾因子是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定。拖尾因子計(jì)算公式為： W0.05hT＝────── 2d1式中 W0.05h為0.05峰高處的峰寬； d1為峰極大至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外，峰高法

14、定量時(shí)T應(yīng)在0.95～1.05之間。峰面積法測(cè)定時(shí)，若拖尾嚴(yán)重，將影響峰面積的準(zhǔn)確測(cè)量。必要時(shí)，應(yīng)在各品種項(xiàng)下對(duì)拖尾因子作出規(guī)定。,20,測(cè)定法,(1)內(nèi)標(biāo)法 按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測(cè)量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子： As／Cs校

15、正因子（f）＝───── AR／CR式中 As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；AR為對(duì)照品的峰面積或峰高； Cs為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度； CR為對(duì)照品的濃度。,21,,再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量供試品中待測(cè)成分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量： Ax含量（Cx）＝

16、f·───── As內(nèi)／Cs內(nèi)式中 Ax為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高； Cx為供試品（或其雜質(zhì)）的濃度； As內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；Cs內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；f為較正因子。,22,,（2）外標(biāo)法：按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì)照品溶液和供試品溶液中待測(cè)成分的峰面積（或峰高），按

17、下式計(jì)算含量 含量（cX）=cR(AX/AR) 式中各符號(hào)意義同上。 由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測(cè)定供試品中成分或雜質(zhì)含量時(shí)，以定量環(huán)或或自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣為好。,23,,（3）面積歸一化法按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測(cè)量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計(jì)算各峰面積占總峰面積的百分率。用于雜質(zhì)檢查時(shí)，由于峰面積歸一化法測(cè)定誤差大，因此，通常只能用于粗略考察供

18、試品中的雜質(zhì)含量。除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。,24,美國(guó)藥典第24版,通法中的高效液相色譜法，簡(jiǎn)要說(shuō)明了本法的特點(diǎn)，指出了本法用于大多數(shù)藥物分析是以分配色譜法為基礎(chǔ)，可在30min內(nèi)完成。敘述分儀器和方法兩部分。在儀器項(xiàng)下，詳細(xì)分述了泵系統(tǒng)、進(jìn)樣器、柱、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)收集裝置。關(guān)于檢測(cè)器，重點(diǎn)討論了常用的分光光度檢測(cè)器。對(duì)于配有單色器的可變波長(zhǎng)檢測(cè)器的波長(zhǎng)準(zhǔn)確度，應(yīng)該用該儀器制造廠提供的方法進(jìn)行校正，如果觀察到的波長(zhǎng)與正

19、確的波長(zhǎng)相差3nm以上，則提示需進(jìn)行再校正。,25,,美國(guó)藥典還討論了多波長(zhǎng)檢測(cè)器，特別是二極管陣列多波長(zhǎng)檢測(cè)器的特點(diǎn)，指出，二極管陣列檢測(cè)器比固定波長(zhǎng)檢測(cè)器或可變波長(zhǎng)檢測(cè)器的信噪比低，不適宜于低濃度化合物的分析。在討論示差折光檢測(cè)器中，認(rèn)為該檢測(cè)器不如紫外光檢測(cè)器靈敏，且受溶劑組成、流速、溫度變化的影響大，要得到滿意的基線，需用參比柱。在方法項(xiàng)下，強(qiáng)調(diào)要用高純度的試劑和HPLC級(jí)的有機(jī)溶劑，色譜用水的電導(dǎo)率和紫外吸收應(yīng)低，并指出，流

20、動(dòng)相的組成對(duì)容量因子的影響遠(yuǎn)大于溫度的影響。本部分還討論了梯度洗脫的應(yīng)用、檢測(cè)器的線性動(dòng)態(tài)范圍（即檢測(cè)器信號(hào)響應(yīng)與被測(cè)成分量呈比例的范圍）、自動(dòng)進(jìn)樣測(cè)定、外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法測(cè)定和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。在通法中還有專門一節(jié)討論系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。,26,英國(guó)藥典2000年版,附錄ID 液相色譜法，簡(jiǎn)要敘述了儀器、方法、歸一化法、效能及與正文有關(guān)的內(nèi)容。在方法項(xiàng)下，說(shuō)明要用對(duì)照溶液測(cè)試，以決定儀器的設(shè)置和獲得適當(dāng)響應(yīng)的注樣量，進(jìn)行重復(fù)進(jìn)樣以驗(yàn)證重復(fù)性，必

21、要時(shí)，還要檢測(cè)理論板數(shù)。除另有規(guī)定外，測(cè)定被測(cè)物峰的峰面積。若被測(cè)物峰的對(duì)稱因子為0.8-1.2，也可測(cè)定峰高。在應(yīng)用梯度洗脫時(shí)，則測(cè)定峰面積。在歸一化項(xiàng)下，說(shuō)明在用歸一化法測(cè)定時(shí)最好使用寬范圍放大器和自動(dòng)積分儀。相鄰兩峰的分離度以半高寬和保留時(shí)間的公式計(jì)算，對(duì)稱因子的計(jì)算公式與中國(guó)藥典中的拖尾因子公式相同，并列出了容量因子計(jì)算公式和信噪比測(cè)定法。在與正文有關(guān)內(nèi)容項(xiàng)下，建議流動(dòng)相要經(jīng)脫氣，脫氣裝置應(yīng)不影響流動(dòng)相的組成；,27,,正文

22、規(guī)定的定量方法如果不是內(nèi)標(biāo)法，建議用固定體積的定量環(huán)進(jìn)樣器；色譜柱通常為不銹鋼柱，其尺寸規(guī)定在正文中（長(zhǎng)度和內(nèi)徑）；正文中規(guī)定的固定相如以字母表示，即指本節(jié)所附的固定相，該固定相的粒度在字母后的括號(hào)內(nèi)寫明，有時(shí)標(biāo)明適用牌號(hào)，并不等于別的牌號(hào)不能用。本節(jié)所附的固定相有：固定相A為硅膠顆粒，固定相B為表面化學(xué)鍵合辛烷基硅烷的硅膠顆粒，固定相C為表面化學(xué)鍵合十八烷基硅烷的硅膠顆粒。除另有規(guī)定外，色譜分離是在恒定的室溫下進(jìn)行，光度檢測(cè)器的