檢驗分析方法的驗證和確認

1、1,分析方法的驗證和確認黑龍江省食品藥品檢驗檢測所戰(zhàn) 丹,可靠的檢驗結果,方法驗證,儀器校準,培訓,3,內容：,一、法規(guī)要求 二、分析方法驗證 三、分析方法確認 四、分析方法驗證和確認總結,4,1、法規(guī)要求：新版GMP（2010年 修訂）,第二百二十三條　物料和不同生產階段產品的檢驗應當至少符合以下要求：?。ㄒ唬┢髽I(yè)應當確保藥品按照注冊批準的方法進行全項檢驗；?。ǘ┓舷铝星樾沃坏模瑧攲z驗

2、方法進行驗證：　　1.采用新的檢驗方法；　　2.檢驗方法需變更的；　　3.采用《中華人民共和國藥典》及其他法定標準未收載的檢驗方法；　　4.法規(guī)規(guī)定的其他需要驗證的檢驗方法?！。ㄈΣ恍枰M行驗證的檢驗方法，企業(yè)應當對檢驗方法進行確認，以確保檢驗數據準確、可靠；,5,1、法規(guī)要求：中國藥典（2010年 版）凡例,檢驗方法和限度二十三、本版藥典正文收載的所有品種，均應按規(guī)定的方法進行檢驗。如采用其他方法，應將該方法與規(guī)定的方

3、法做比較試驗，根據試驗結果掌握使用，但在仲裁時仍以本版藥典規(guī)定的方法為準。,6,1、法規(guī)要求：中國藥典（2010年 版）凡例,檢驗方法和限度二十三、本版藥典正文收載的所有品種，均應按規(guī)定的方法進行檢驗。如采用其他方法，應將該方法與規(guī)定的方法做比較試驗，根據試驗結果掌握使用，但在仲裁時仍以本版藥典規(guī)定的方法為準。,1、法規(guī)要求：分析方法確認或驗證相關指南,8,內容：,一、法規(guī)要求 二、分析方法驗證 三、分析方法確認

4、 四、分析方法驗證和確認總結,9,二、分析方法驗證1、分析方法驗證的定義2、分析方法驗證的目的3、分析方法驗證范圍4、分析方法驗證的時機5、需驗證的分析方法類型6、分析方法驗證的具體內容7、驗證檢測項目小結8）分析方法驗證的方式和步驟9）分析方法驗證常見問題,10,二、分析方法驗證,1、分析方法驗證的定義：是根據檢測項目的要求，預先設置一定的驗證內容，并通過設計合理的試驗來驗證所采用的分析方法能否符合檢測項目的要求

5、。2、分析方法驗證的目的：1）證明采用的分析方法是科學、合理，2）證明分析方法能有效控制藥品的內在質量。 ? 驗證過程和結果均應記載在標準起草或修訂說明中。,二、分析方法驗證,3、分析方法驗證范圍適用范圍化學藥品的理化分析方法和儀器分析方法的驗證與確認清潔驗證方法的驗證不適用化學藥品的微生物方法生物制品分析方法驗證,4、分析方法驗證的時機1）建立新的藥品質量標準；2）藥品生產工藝變更；3）制劑的組分變更；4

6、）對原分析方法進行修訂時。 方法驗證理由、過程和結果均應記載在藥品標準起草說明或修訂說明中。,二、分析方法驗證,二、分析方法驗證,5、需驗證的分析方法類型1）鑒別試驗2）雜質定量或限度檢查（儀器或非儀器檢測方法），3）原料藥或制劑中活性成分以及制劑中選定組分（如防腐劑等）的定量測定含量測定4）化學藥品/中藥制劑中其他需控制成分(如殘留物、添加劑等）的測定5）制劑溶出度、釋放度等檢查6）原料藥粒度檢測 ---,1

7、）專屬性2）線性3）范圍4）準確性5）精密度6）檢測限7）定量限8）耐用性9）系統適用性,6、分析方法驗證的具體內容,根據檢測的類型采用的技術檢測方法確定具體方法擬訂驗證的內容,二、分析方法驗證,1）專屬性,鑒別、雜質和含量測定的方法學驗證中應進行專屬性研究，證明專屬性所采用的方法取決于分析方法的預定檢測對象。 一種分析方法不太可能對某一特定的被分析物具有專屬性(完全辨別)，在此情況下，建議采用兩種或兩種

8、以上的分析方法以達到所需的辨別水平。,1）專屬性,鑒別 合適的鑒別實驗應能區(qū)別出可能存在結構相似的化合物?？梢酝ㄟ^與已知參比物比較，從含有被分析物的樣品中得到的正結果和不含被分析物的樣品中得到的負結果來確定。此外，也可以采用與被測物結構相似或相關的物質進行鑒別實驗。對于這些可能會有潛在干擾的物質的選擇應當基于對這些干擾的物質做出合理的科學評判。,1）專屬性,含量測定和雜質檢測 對于色譜方法來說，應當用具有代表性

9、的色譜圖來證明專屬性，并在圖上適當地標出每一種成分，其他分離技術也應當有相似的考慮。應當在適合的程度上研究關鍵的色譜分離度。對于關鍵的分離度，能夠通過兩個洗脫最靠近的化合物之間的分辨率來證明方法的專屬性。 當用非專屬性方法做含量測定時，應當采用其他輔助性的分析方法來證明整體的專屬性，例如：當為了放行而采用滴定法測定原料藥含量時，可以合并采用這種含量測定方法以及一種適當的雜質檢查方法。,1）專屬性,常用的試驗方法: 空白陰性對

10、照試驗 比較同一分析系統對照品與供試品相應色譜峰的吸收光譜 色譜-質譜聯用驗證待測成分,2）線性,線性系指在設計的范圍內，測試結果與供試品中被測物濃度直接呈正比關系的程度。試驗方法制備至少包含5個濃度（梯度濃度）的對照品溶液，分別進樣測定以測得的響應信號作為被測物濃度的函數作圖，觀察是否呈線性最小二乘法進行線性回歸 數據要求： 應列出回歸方程、相關系數和線性圖,3）范圍,范圍系指能達到一定精密度、準確度和線性，測試

11、方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。 確認方法是通過把含有被測物的樣品在范圍的兩個極端和范圍內進行測試，考察是否可達到精密度、準確度的線性的要求。,3）范圍,3）范圍（中藥和復方制劑）,含量限度有上下限的，一般設定范圍低限為含量限度下限的50～70％，范圍的高限為含量限度上限的130～150％。含量限度僅有低限的，一般設定范圍為含量限度的50％～70％至含量限度的2～5倍以上。以標示量規(guī)定含量限度的，可參照化學藥， 一般設

12、定范圍為標示量的80％～120％。,中藥含量限度的確定,含量限度應根據中藥制劑實測結果與原料藥材的含量情況確定。盡可能多的測定數據才有足夠的代表性，至少應有10批以上樣品與原料藥材數據為依據，一般原粉入藥的轉移率要求在90%以上。 有毒成分及中西藥復方制劑中化學藥品的含量應規(guī)定上下限，上下限幅度應根據測試方法、品種情況、轉移率及理論值確定，一般應在±5%～±20%之間，并在安全有效范圍內，制定上下限應有充分依

13、據。,4）準確度,系指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率(%)表示。 a. 以經典方法的測定值作為真值，建立方法的測定數據與之比較（該法適用于化學藥品） b. 以加入對照品測定的回收率表示，一般有空白回收（制劑空白）和加樣回收測定的方法（中藥材、復方制劑等）,4）準確度,回收試驗： 加樣回收試驗：,4）準確度 —原料藥,用已知純度的被分析物(如參比物質)進行測定用提出的分析方法的檢

14、測結果與第二種成熟的分析方法的檢測結果做比較，而后者的準確性是有規(guī)定的和(或)經確定的。準確性可以在精密度、線性和專屬性建立后，推論而得.,4）準確度 —制劑,用該分析方法測定藥物制劑成分與添加的已知量被分析原料藥的混合物?如在不能獲得制劑所有成分的樣品時，可以將已知量的被分析物加入到制劑中，或者將測得的結果與另一種已鑒定分析方法的分析結果進行比較，而后者的準確性是有規(guī)定的和（或)經確定的。 在精密度、線性和專屬性建立后，可以推

15、斷準確性。,4）準確度-雜質的定量測定,應當通過用已知量雜質加強樣品(原料藥／制劑)檢測信號的方式來評價準確性。 在不能獲得特定雜質和（或）降解產物樣品的情況下，可以考慮與另一種成熟的方法所測得的結果做比較?？梢允褂迷纤幍捻憫蜃?。如藥典方法或經過驗證的方法。 應當明確如何確定每個單一雜質或總雜質：如：所有成分相對于主摹被分析物的重量／重量首分比或峰面積百分比。,某成分含量測定－回收率1,某成分－回收率2,某成分含量測定－

16、回收率3,5）精密度,精密度系指在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻供試品，經多次取樣測定所得結果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。重復性 中間精密度 重現性,5）精密度--驗證方法,6）檢出限（Limit of Detection，LOD),檢測限系指供試品中被測物能被檢測出的最低量。 a.非儀器分析目視法 通過對一系列含有已知濃度分析物的樣品進行分析，以確定能夠被可靠測定的分析物的最低濃

17、度。 b.儀器法（信噪比法） 該方法僅適用于出現基線噪音的分析方法。信噪比的確定是通過比較含已知低濃度被分析物樣品與空白樣品的測試信號，確定被分析物可以靠被檢測到的最小濃度。通常信噪比為3：1或2：1時，檢測限可以被接受。,6）檢出限（Limit of Detection，LOD),檢測限系指供試品中被測物能被檢測出的最低量。 c.響應值的標準差和斜率檢測限(DL)可以表達為：DL=3.3σ /S式中，σ為響應值的

18、標準差；S為校正曲線的斜率。斜率s可從被分析物的校正曲線來估算，而σ值可 由多種途徑估算。例如：基于空白的標準差基于校正曲線,6）檢出限（Limit of Detection，LOD),數據要求應當提供檢測限和測定檢測限的方法如果方法采用目測法和信噪比法，應提供測試圖譜如果通過計算或外推法得到檢測限的估算值，可對一系列或等于檢測限樣品的獨立分析來驗證這一估算值。,7）定量限（Limit of Quantitative,

19、LOQ）,定義：定量限系指供試品中被測成分能被定量測定的最低量，其測定結果應具一定準確度和精密度。雜質和降解產物用定量測定方法研究時，應確定定量限。 試驗方法：目測法：信噪比法：以信噪比10:1時的濃度(或量)進樣測定,重復測定的響應值應滿足精密度要求?；陧憫档臉藴什詈托甭?8）耐用性,定義：耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度。 耐用性進行評估應當在研制階段就加以考慮，它取決于所研究的

20、分析方法類型。應表明在對方法參數進行有意改變后，分析方法依然可靠 如果測定的結果表明該方法對分析條件的變化是敏感的，那么這些分析條件就應適當地加以控制或在方法中預先提出告誡。因此應當對耐用性進行評估，并建立一系列的系統適用性參數(如分離度實驗)，以確保該分析方法在任何時候都可以保持有效性。 如果測試條件要求苛刻，則應在方法中寫明。,8）耐用性--考察因素,分析溶液的穩(wěn)定性樣品的提取次數、時間液相色譜方法 流動

21、相pH值變化的影響 流動相組分變化的影響； 不同色譜柱(不同的批號和／或供應商)； 溫度； 流速。,8）耐用性--考察因素,氣相色譜方法： 不同色譜柱(不同的批號和／或供應商)； 溫度 流速 固定相 不同類型的載體,8）耐用性---考察因素,薄層色譜法： 不同品牌的薄層板點樣方式薄層展開時溫度及相對濕度的變化,8）耐用性：試驗示例--不同柱溫比較,8）耐用性試驗示例-

22、-不同檢測波長的比較,8）耐用性試驗示例-流動相組成比例變化比較,8）耐用性---試驗示例,某含量測定－提取條件選擇,選擇50ml甲醇超聲提取40分鐘,9）系統適用性試驗,系統適用性實驗是許多分析方法的組成部分，這些實驗的基本概念是要把由分析設備、電子儀器、實驗操作和被分析樣品所組成的完整系統進行整體評估。對于特定方法的系統適應性參數的建立依賴于被驗證方法的類型。進一步信息可參考藥典。,二、分析方法驗證7、驗證檢測項目小結,1、鑒別

23、 鑒別的目的在于判定被分析物是目標化合物，而非其它物質，用于鑒別的分析方法要求具有較強的專屬性。2、雜質檢查（限度試驗、定量試驗） 雜質檢查主要用于控制主成分以外的雜質，如有機雜質、無機雜質等。 雜質檢查要準確反應供試品的純度特性，可分為限度試驗和定量試驗兩種情況。用于限度試驗的分析方法驗證側重專屬性和檢測限。用于定量試驗的分析方法驗證強調專屬性、準確度和定量限。,3、定量測定 定量測

24、定包括含量測定、制劑的溶出度（釋放度）測定等，由于此類項目對準確性要求較高，故所采用的分析方法要求具有一定的專屬性、準確度和線性。4、其他特定檢測項目。 其他特定檢測項目包括粒徑分布、旋光度、分子量分布等，由于這些檢測項目的要求與鑒別、雜質檢查、定量測定等有所不同，對于這些項目的分析方法驗證應有不同的要求。,二、分析方法驗證7、驗證檢測項目小結,需驗證項目,注意：-表示通常不需要做的項目：+表示通常需要做的項目。①假

25、如已做了重現性（見術語表），就不需再做中間精密度；②分析方法缺乏專屬性，可以由其他分析方法來補充；③有些情況下可能需要。,8）分析方法驗證的方式和步驟分析方法應給出完成每個分析試驗所需的詳細步驟。可能包括供試品、對照品和試劑的配制和制備；儀器的使用說明；標準曲線的繪制；計算公式的使用等信息，當然，分析方法的內容不僅限于上述信息。 在實際工作中，可以對實驗工作進行充分的設計，使得可以同時考察多個適當的驗證

26、項目，提供分析方法科學的、綜合的能力情況，比如：專屬性、線性、范圍、準確度和精密度等。,,二、分析方法驗證,9）分析方法驗證常見問題,藥味的選擇問題供試品溶液制備考察不全面 對照品溶液濃度與供試品不匹配標準曲線的制備 樣品測定不在線性范圍之內取樣、范圍太小、單位等問題色譜條件的選擇 應詳述理由并附相關圖譜方法改變后應與原方法作比較對照品溶液的制備 對照品稱量難以達到精密稱定的要求回收率測定問題,9）分析方法驗證常見問

27、題,耐用性考察問題特殊劑型如分散片建議研究建立主要成分的溶出度檢查方法 ，限度的制定有時不能照搬二部藥典單味制劑 應作輔料空白樣品，進行空白對照試驗正文 不規(guī)范,53,內容：,一、法規(guī)要求 二、分析方法驗證 三、分析方法確認 四、分析方法驗證和確認總結,三、分析方法確認,分析方法確認 一個闡述通過已驗證方法進行產品測試的條件確實適合于該驗證方法的過程適用范圍 物料和產品中不需要進行驗證的

28、檢驗方法以及藥典方法和其他已驗證的法定標準。通過方法確認來證明在本實驗室條件下的適用性。不適用于： 日常檢驗一般理化方法。如干燥失重、熾灼殘渣。 分析方法的驗證通常在產品的研發(fā)階段已經進行。 應關注不同實驗室之間方法轉移時的確認。,55,55,三、分析方法確認,采用藥典規(guī)定的檢驗方法需要確認的目的： 在于提供第一次使用實驗室的人員、設備和試劑進行法定分析方法確認時得到可接受結果的基本信息。 確

29、認包括所選擇的方法性能參數，如那些在USP中描述的，是產生相關數據而不是重復驗證過程。 方法使用者應有相當的經驗、知識并經過培訓能夠按照書面的法定方法進行操作。由使用者進行方法確認可以提供法定方法能夠適合相應的測試目的的信心。 盡管缺認法定方法在真實條件下使用時的適應性不需要進行完整的再驗證過程，列在表2中的一些分析參數可以在確認過程中使用。特定方法的確認僅需要對被認為適宜的參數進行評估。,56,法定方法確認,除非有跡象

30、顯示法定方法不適應各論下測試要求，一些基本的常規(guī)方法不需要做驗證。基本法定分析方法包括但不限于：干燥失重、熾灼殘渣、各種化學檢測如酸度檢測，簡單的儀器分析如用pH值測試儀測定pH值。藥典建議，對于首次使用藥典方法進行常規(guī)檢測的實驗，應考慮到任何新的或不同的樣品或溶液的處理要求。,三、分析方法確認,,,比對人員儀器實驗室間比對,,,,,確認方式,檢驗項目確認鑒別--專屬性雜質—專屬性、精密度、定量限含量—準確度、專屬性,58,

31、原料藥檢測方法示例,Identification鑒別IR, UV HPLC Purity test檢查?Loss on drying干燥失重, residue on ignition, 熾灼殘渣Heavy metals重金屬pHRelated substances有關物質Assay 含量測定Titrimetry滴定法HPLC,,59,原料藥檢測方法示例,Identification鑒別IR, UV HPLC P

32、urity test檢查?Loss on drying干燥失重, residue on ignition, 熾灼殘渣Heavy metals重金屬pHRelated substances有關物質Assay 含量測定Titrimetry滴定法HPLC,,60,原料藥檢測方法示例,Identification鑒別IR, UV HPLC Purity test檢查Loss on drying干燥失重, residue o

33、n ignition, 熾灼殘渣Heavy metals重金屬pHRelated substances有關物質Assay 含量測定Titrimetry滴定法HPLC,,61,原料藥檢測方法示例,Identification鑒別IR, UV HPLC Purity test檢查Loss on drying干燥失重, residue on ignition, 熾灼殘渣Heavy metals重金屬pHRelated

34、 substances有關物質Assay 含量測定Titrimetry滴定法HPLC,,62,原料藥檢測方法示例,Identification鑒別IR, UV HPLC Purity test檢查?Loss on drying干燥失重, residue on ignition, 熾灼殘渣Heavy metals重金屬pHRelated substances有關物質Assay 含量測定Titrimetry滴定法H

35、PLC,,63,制劑檢測方法示例,Identification鑒別HPLC Purity test檢查?Particle in injectionsUniformityDissolutionImpurities:雜質related substancesresidual solventsAssay 含量測定,,64,制劑檢測方法示例,Identification鑒別HPLC Purity test檢查?Partic

36、le in injectionsUniformityDissolutionImpurities:雜質related substancesresidual solventsAssay 含量測定,,65,制劑檢測方法示例,Identification鑒別HPLC Purity test檢查?Particle in injectionsUniformityDissolutionImpurities:雜質related

37、 substancesresidual solventsAssay 含量測定,,66,制劑檢測方法示例,Identification鑒別HPLC Purity test檢查?Particle in injectionsUniformityDissolutionImpurities:雜質related substancesresidual solventsAssay 含量測定,,67,** 如果缺少指導書可能影