葡萄砧木PGIP基因的克隆及轉化煙草的研究.pdf

1、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)是多種病原真菌的致病因子，是病原真菌入侵過程中分泌的第一個細胞壁降解酶。而多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalaeturonase-inhibiting protein,PGIP)是一種特異性細胞壁結合蛋白，富含抗病基因所具有的亮氨酸重復序列(Leucine-rich repeat, LRR)，非競爭性地抑制病原真菌PG酶的活性，減少PG對植物細胞壁的降解，誘導植物的抗病性

2、反應，從而抑制了真菌病害的發(fā)生。
　　 本實驗以‘5BB’(Vtis berlandieri×V.riparia)、‘1202’(V.vinifera× V.rupestrsis)和‘Beta’(V.riparia×V.labrusca)三種葡萄砧木為材料，克隆了‘5BB’、‘1202’和‘Beta’PGIP基因，并用生物信息學的方法分析其結構和功能。同時構建了‘5BB'PGIP基因的高效表達載體(pYF7704)，進行了煙草的

3、遺傳轉化研究。現將主要研究結果匯總如下：
　　 1.以葡萄砧木‘5BB’、‘1202’和‘Beta’葉片為試材，通過設計特異引物，PCR擴增，從上述砧木基因組中分別得到1條全長1002bp的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因序列(‘5BB’PGIP基因GenBank的登錄號：FJ530941；‘1202’PGIP基因GenBank的登錄號：GQ139363；‘Beta' PGIP基因GenBank的登錄號：GQ139364)。

4、　　 2.對‘5BB’、‘1202’和‘Beta' PGIP基因序列進行生物信息學分析，結果表明，它們都包含1個完整的開放閱讀框；均編碼333個氨基酸，蛋白質分子量分別為：37.07Kda、37.09 Kda和37.09 Kda;等電點分別為：8.683、8.684、8.257;疏水性和親水性分析及信號肽分析表明：第1-27個氨基酸殘基是信號肽；序列同源比對結果顯示，與歐洲葡萄、其它果樹的相應序列同源性分別為99％和68％;其推導的蛋

5、白質序列中包含一段亮氨酸重復序列，三級結構和菜豆PGIP相似.
　　 3.將構建好的‘5BB'PGIP基因表達載體(pYF7704)通過農桿菌介導法轉化煙草，最終獲得102個抗性株系.經過PCR檢測，從10株中擴增出了目的條帶。進一步的RT-PCR檢測結果表明，有5個為陽性株系.初步證實，‘5BB'PGIP基因已經整合到煙草的基因組中.通過對轉基因株系與未轉基因植株對照植株的SOD和CAT酶的活性檢測，發(fā)現轉‘5BB’PGIP基