斑節(jié)對蝦性腺差異表達基因的篩選、克隆及表達分析.pdf

1、斑節(jié)對蝦為重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖對蝦品種，在養(yǎng)殖條件下，其難以完成性腺發(fā)育過程并自然產(chǎn)卵，通常需用眼柄去除手術(shù)進行人工催熟，而這種手術(shù)方法容易導致親蝦死亡、卵質(zhì)量下降等弊端。目前尚無其它更好的催熟技術(shù)用于啟動斑節(jié)對蝦的性腺發(fā)育，對對蝦繁育過程中性腺發(fā)育分子調(diào)控機制也不清楚，生產(chǎn)實踐和自然科學探索都迫切需要對對蝦繁殖分子調(diào)控機制有一個較深層次的了解。從分子水平認識對蝦性腺發(fā)育的分子作用機制，探討對蝦性腺發(fā)育調(diào)控機制，發(fā)展新的催熟技術(shù)，已成為當前研

2、究熱點。而目前認識斑節(jié)對蝦性腺發(fā)育的分子機制的首要任務為篩選和鑒定與性腺發(fā)育相關(guān)的基因。 本研究利用mRNA差異顯示技術(shù)，選取池塘養(yǎng)殖250日齡的斑節(jié)對蝦為研究對象，篩選其性腺差異表達基因。首先利用3條3'端錨定引物反轉(zhuǎn)錄斑節(jié)對蝦性腺總RNA，將得到的6種反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與8條隨機引物配對，進行24組cDNA擴增反應，將獲得的PCR產(chǎn)物進行6％尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、硝酸銀顯色，最終獲得173條差異片段。隨機選取其中44條片段

3、回收，經(jīng)克隆測序及熒光定量PCR驗證，最終獲得10條陽性差異表達片段，其中OA7-1、OA7-2、OG8-1、OG8-2、OC1-3、OC4-2、OC8在卵巢中表達量極顯著(P<0.01)高于精巢，TG6-3、TG8在精巢中表達量極顯著(P<0.01)高于卵巢，TC1為精巢特異表達片段。 利用已獲得的陽性克隆片段與本人所在實驗室已測序完成的斑節(jié)對蝦混合組織cDNA文庫中的EST序列進行比對分析，進行電子克隆，并結(jié)合5'RACE技

4、術(shù)獲得斑節(jié)對蝦e1F3g(btseIF3g)、核糖體蛋白L3(btsRPL3)和L7(btsRPL7)的全長cDNA序列及一條精巢特異表達基因(btsTC1)的cDNA片段。 采用熒光定量PCR及RT-PCR方法分析了btseIF3g、btsTC1和TG6-3在250日齡的斑節(jié)對蝦各組織中的表達特性。btseIF3g在卵巢組織中的高表達現(xiàn)象暗示了其可能參與斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育；btsTC1只在精巢組織中表達，而在卵巢及雌、雄性個體的