BmCPV感染家蠶中腸組織轉錄組的比較研究及BmCPV片段1中假定重疊基因的鑒定.pdf

1、家蠶(Bombyx mori)是重要的經濟昆蟲，已有5700多年的飼養(yǎng)歷史。中腸是家蠶消化吸收營養(yǎng)物質的重要器官，也是家蠶抵抗病原菌侵染的第一道生理屏障。家蠶質型多角體病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus，BmCPV)是養(yǎng)蠶業(yè)的主要病原之一。利用高通量轉錄組測序技術（RNA-Seq）研究感染BmCPV的家蠶中腸轉錄組學，對深刻理解宿主對BmCPV的感染及家蠶與BmCPV互作有重要作用

2、。
　　本文首先對藍5、瓊10、歐17、大造四個家蠶品種對BmCPV家抵抗性進行了研究。用108、107、106、105、104、103 BmCPV多角體/ml懸液經口感染3齡起蠶，7天后統(tǒng)計發(fā)病蠶數，利用機率分析法計算半致死劑量(LD50)。結果顯示4個家蠶品種對BmCPV抗性由強到弱依次為歐17，大造，瓊10，藍5，其相應的LD50分別為8.03、6.68、6.23和5.60。
　　選擇敏感性品種藍5為研究對象，取感染B

3、mCPV36、72、108、144及180h后家蠶中腸組織的等量混合mRNA和相應健康家蠶中腸組織的等量混合mRNA，利用RNA-Seq技術開展了家蠶感染BmCPV（藍5-CPV）與健康家蠶中腸（藍5）比較轉錄組學研究。在對差異表達基因進行了GO和KEGG信號通路分析的基礎上，隨機選取了6個差異表達基因（上調、下調基因各3個）通過qRT-PCR對高通量測序結果進行驗證。主要結果如下:
　　1.正常藍5家蠶中腸組織中共有10812個

4、基因表達，與家蠶Actin A3基因表達水平比較，log2(Fold change)＞2的中腸組織中高量表達基因有66個，這些基因的產物主要涉及消化、吸收、蛋白合成以及天然免疫。
　　2.感染BmCPV后，藍5的中腸組織中共有11259基因表達，F(xiàn)old change(FC)達到顯著性的差異表達基因（即只在一個樣本中表達的差異基因）共387個，其中感染后表達上調的基因264個，下調基因123個;T-test達到顯著性的差異表達基因

5、（二個樣品均表達的差異表達基因）共90個，其中感染后表達上調的基因66個，下調基因24個。
　　3.GO分析結果顯示，表達上調基因主要集中在結合（如ATP的解旋酶DDX18基因）、代謝進程（如DNA胞嘧啶甲基轉移酶基因）、細胞進程（如神經肽受體A33基因）等亞類。表達下調的基因主要集中在催化活性（如肽聚糖識別蛋白LB基因）、結合（如分選微管連接蛋白8基因）、代謝進程（如1型半胱氨酸加雙氧酶）等亞類。
　　4.KEGG通路分析

6、結果顯示，感染BmCPV后，下調基因主要涉及到消化和吸收、碳水化合物代謝通路的基因，如絲氨酸蛋白酶基因、乙醇脫氫酶基因;上調基因主要集中到信號轉導通路，如MAPK信號通路（如D型電壓依賴型離子通道蛋白基因）、Wnt信號通路（如蓬松蛋白激活因子基因）、鈣離子信號通路（如鈣調蛋白腺苷酸環(huán)化酶基因）以及與運輸、分解相關通路，如內吞作用（如分選缺陷蛋白6基因）和溶酶體（如CD63抗原蛋白基因）等。另一方面，宿主細胞為抵制病毒的入侵可能啟動了凋亡

7、機制來清除被感染的細胞，病毒的入侵也誘導了一些與自身免疫相關的基因的表達上調，如絲氨酸蛋白酶抑制劑、脂酶、表皮蛋白、圍食膜幾丁質結合蛋白、細胞色素P450基因、DAAM1蛋白基因等。
　　5.隨機選取Osiris9、未知蛋白1(367)、未知蛋白2(loc)、27kD糖蛋白前體、酯酶B1、肽聚糖識別蛋白S6共6個基因，用qRT-PCR檢測感染病毒和健康家蠶的表達水平的變化，結果顯示Osiris9、未知蛋白1、未知蛋白2基因的表達水

8、平分別上調了16.34倍、19.42倍、41.93倍，27kD糖蛋白前體、酯酶B1、肽聚糖識別蛋白S6基因表達水平分別下調了36.25倍、15.1倍、66.71倍，與高通量測序結果一致，表明此次高通量測序分析結果可信度較高。
　　上述結果全面揭示了家蠶對BmCPV的感染應答，為理解家蠶與BmCPV的相互關系提供了新的線索。
　　對BmCPV進行生物信息學分析結果顯示在其基因組S1片段中包含有一個假定的重疊基因ORFX。為了檢

9、測該重疊基因ORFX是否在RNA和蛋白水平有相應的表達產物，用大腸桿菌表達的重組ORFX蛋白制備的多克隆抗體，對感染BmCPV的家蠶中腸后部組織進行Western blotting和免疫組化檢測。結果顯示，在感染BmCPV第1～7天的中腸組織中沒有檢測到假定的ORFX蛋白。進一步基于假定的重疊基因ORFX區(qū)域及其下游序列設計定量檢測ORFX基因和S1片段轉錄本RNA總水平的引物RECPV-1/RECPV-2，以及定量檢測S1片段轉錄本R