辣椒疫霉(Phytophthora capsici)10個果膠裂解酶基因克隆及pcpel1的功能研究.pdf

1、辣椒疫病是一種在世界范圍內(nèi)的土傳病害，也是我國辣椒生產(chǎn)上廣泛發(fā)生的主要病害之一，近年來由于集約化種植，重茬嚴重，導致辣椒疫病日趨嚴重，引起大幅度減產(chǎn)，給辣椒生產(chǎn)帶來了極大的危害。辣椒疫病病原是辣椒疫霉菌(Phytophthors capsici)，是一種土傳卵菌，以卵孢子或厚垣孢子在土壤病殘體中越冬，可以存活數(shù)月甚至更長時間，在適宜條件下引起青椒莖腐、根腐和枯萎，寄主范圍廣，給我國的及世界各國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。 目前

2、，對于辣椒疫病的防治主要采用化學防治，而培育抗病品種效果不穩(wěn)定，原因之一是辣椒疫霉具有較強的變異能力。因此，探索辣椒疫霉菌重要的致病因子，研究抗病性生理生化機制，結合抗病性遺傳，抗病基因的QTL定位(quantitative trait loci)與基因工程，進行抗病性鑒定和抗病育種方面研究成為病害防治的前景。其中細胞壁降解酶在病害致病關鍵因子之一，包括角質(zhì)酶(cutinase)，果膠酶(pectinase)，纖維素酶(cellulas

3、e)，半纖維素酶(hemicellulase)，蛋白酶(protease)等。而果膠酶又包括多聚半乳糖醛酸酶(PG)，果膠甲基酯酶(PME)，果膠裂解酶(PL)。果膠裂解酶(PL)是許多植物病原菌分泌的一種果膠酶，能降解植物細胞壁，許多病原真菌，卵菌，細菌在侵染過程都能分泌果膠裂解酶。本文以辣椒疫霉菌為研究對象，克隆了辣椒疫霉果膠裂解酶基因，并進行體外表達研究。 以辣椒疫霉強致病和果膠裂解酶活性高的菌株為實驗材料構建的DNA文庫

4、，借助Pool-PCR技術分離了10個果膠裂解酶基因。對基因結構分析發(fā)現(xiàn)10個pel基因具有較高的同源性，并具有不同數(shù)目的糖基化位點，所編碼的蛋白具果膠裂解酶的保守序列和蛋白活性位點。本研究發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉pel基因與其他疫霉pel基因具高度保守序列，也證明了辣椒疫霉菌在自然界中的分類地位。并且對其中一個基因構建質(zhì)粒進行體外誘導表達，制備了多克隆抗體，借助蛋白印記雜交驗證了重組蛋白的免疫活性，利用RT-PCR技術檢測了其在發(fā)病辣椒葉片內(nèi)的

5、表達情況，其具體研究結果如下： 1、Pool-PCR法篩選基因文庫，分離了10個果膠裂解酶基因 從GenBarlk中下載若干pel基因，同源比對設計多對引物，然后進行反復篩選，分離了3個全長和7個非全長基因。將所克隆的10個基因經(jīng)過Blast搜索，結果顯示全部為果膠裂解酶基因。經(jīng)過DNAman軟件處理分析了這10個基因的基本結構，最大開放閱讀框長度為1200-1800 bp，編碼370-500個氨基酸，預測氨基酸分子量為

6、37-55kDa。利用SignalP 3.0 setver和NetNGlyc 1.0 servet對這10個基因的信號肽和N糖基化位點進行預測，信號肽長度一般為21.22個氨基酸，N-端糖基化位點以1個的居多，只有pcpel1基因有6個糖基化位點。10個基因的理論PI值差異較大。 2、擴增非全長的pcpe1基因 使用兩種方法擴增非全長基因的未知端序列： (1)RACE法：將辣椒疫霉菌置于三角瓶進行振蕩培養(yǎng)7天后，

7、收集菌絲。然后液氮研磨，利用Trizol法提取總RNA，經(jīng)反轉錄酶作用，合成cDNA，作為模板，以通用引物(USP)和基因特異引物(GSP)進行第一輪PCR；以第一輪產(chǎn)物做模板，用巢式特異引物(NGSP)和巢式通用引物(NUSP)進行第二輪PCR，目的片段回收，連接，轉化大腸桿菌DH-5α后，送樣測序。將測序片段拼接后，對其進行了初步分析，將兩個非全長的基因補充完整，獲得了理論全長基因。 (2)TAIL-PCR法：將辣椒疫霉菌置

8、于三角瓶進行振蕩培養(yǎng)5天后，收集菌絲。然后液氮研磨，利用CTAB法提取總DNA，作為模板，以隨即簡并引物(AD)和基因特異引物(GSP)進行第一輪熱不對稱交錯PCR；以第一輪產(chǎn)物做模板，用AD引物與第二輪GSP引物進行第二輪PCR，以此類推第三輪，直到得到已知序列的側翼序列，經(jīng)電泳檢測、PCR產(chǎn)物回收，連接，轉化大腸桿菌DH-5a后，送樣測序。將測序片段拼接后，對其進行了初步分析，最終將非全長的基因補充完整，獲得了4個基因的理論全長序列

9、。 3、pcpel1的真核表達 根據(jù)已經(jīng)克隆的pcpel1基因序列，設計特異性引物，PCR擴增其成熟肽片斷。重組至酵母分泌型表達載體pPIC9K，構建重組表達載體pPIC9K/pcpel1，轉化大腸桿菌DH5a，篩選得到陽性克隆。重組質(zhì)粒經(jīng)Sal I線性化后轉化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，經(jīng)G418篩選和PCR擴增轉化子基因組篩選，得到數(shù)株基因工程酵母菌。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，重組蛋白進行了特異表達，分子量大小約

10、為65kDa。 4.RT-PCR和Western Blot 利用SDPH-33接種的4-6葉辣椒葉片，提取發(fā)病葉片的總RNA，合成cDNA。根據(jù)pcpel1的序列設計特異性引物，用RT-PCR技術檢測接種葉片內(nèi)pcpel1的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，接種后pcpel1在發(fā)病辣椒體內(nèi)均能表達，其表達量隨著時間的延長而加強，第七天表達量最高。通過將酵母分泌的PCPEL1蛋白免疫家兔，制備特異性抗體。Western blot分析結果