皺紋盤鮑基質金屬蛋白酶基因的克隆及表達分析.pdf

1、基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一類鋅離子依賴型內肽酶，屬于金屬蛋白酶類。MMPs的主要底物膠原蛋白是動物肌肉的重要組成成分，因此，MMPs參與肌肉蛋白新陳代謝，與肌肉質構變化密切相關。貝類是我國重要經濟水產動物，但目前貝類MMPs基因的存在形式及MMPs與肌肉蛋白的相互作用關系卻鮮有報道。本研究以皺紋盤鮑(Haliotis discus hanai)為研究對象，采用分子生物學技術克隆得到

2、MMPs基因序列并利用大腸桿菌及畢赤酵母表達系統(tǒng)實現重組蛋白的異源表達，對MMPs在皺紋盤鮑不同組織中的相對表達量及其與鮑魚肌肉蛋白的相互作用進行了初步研究。
　　首先，利用同源克隆及RACE技術從皺紋盤鮑肌肉中克隆得到MMP-1(Hdh-MMP-1)及MMP-2(Hdh-MMP-2)基因cDNA序列。Hdh-MMP-1(GenBank登錄號KR537291.1)cDNA全長2136 bp，其中開放閱讀框(ORF)1551bp，編

3、碼516個氨基酸，預測分子量58.94 kDa，理論等電點為5.99，其含有MMP家族典型的前肽區(qū)、催化區(qū)、鉸鏈區(qū)及類血紅素結合區(qū)。BLAST結果顯示，Hdh-MMP-1與多種鮑類MMP-1、某些軟體動物和蟲類MMPs氨基酸序列相似。Hdh-MMP-2(GenBank登錄號KX058128.1)基因1644 bp，預測分子量61.66 kDa，理論等電點為5.19，除MMP家族典型的區(qū)域外，還含有明膠酶特有的II型纖連蛋白結合區(qū)。Hdh

4、-MMP-2與多種無脊椎軟體動物及哺乳動物MMP-2具有序列相似性，表明該基因在不同物種間較保守。SOPMA預測結果顯示Hdh-MMPs二級結構元件均含α螺旋結構，β轉角結構，延伸鏈及無規(guī)卷曲。此外，分別以人MMP-1、大西洋鮭MMP-2作為建模模板，模擬了Hdh-MMPs的三級結構。
　　其次，構建原核表達質粒 pET-cMMP-1，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)成功表達并純化得到重組 Hdh-cMMP-1，將其用于制備特異兔抗鮑魚 MM

5、P-1多克隆抗體。同時，利用畢赤酵母真核表達系統(tǒng)成功表達分子量約為90 kDa的重組Hdh-MMP-1，明膠酶譜結果顯示該蛋白具有降解明膠的生物活性。進一步構建表達質粒 pET-cMMP-2及融合表達質粒MBP-cMMP-2并轉入大腸桿菌表達宿主，成功誘導表達并純化得到以包涵體形式及可溶形式表達的重組Hdh-cMMP-2。但兩種表達方式獲得的目的蛋白均無生物活性，此后對重組蛋白二級結構進行分析，并且與重組刺參MMP-2蛋白進行比較。

6、r>　　最后，利用熒光定量PCR研究了Hdh-MMPs基因在皺紋盤鮑不同組織中表達量差異，結果顯示，Hdh-MMPs基因在所檢測的各組織中均有不同程度表達，且在血細胞及腮等免疫相關組織中表達量最高，表明 Hdh-MMPs在皺紋盤鮑免疫調控環(huán)節(jié)具有一定生物功能。用致病菌副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)感染皺紋盤鮑，研究感染前后肌肉質構變化及 Hdh-MMPs基因相對表達量變化情況。結果顯示，一次染菌后鮑魚肌肉