農(nóng)桿菌介導(dǎo)的淀粉分支酶基因轉(zhuǎn)化秈稻的研究.pdf

1、本研究利用從玉米上克隆的三個淀粉分支酶基因（sbeⅠ，sbeⅡa，sbeⅡb），構(gòu)建適合水稻轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體，建立適合于高直鏈淀粉含量的供試水稻品種“抗蚊青占”的再生體系和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并進(jìn)行SBE基因的遺傳轉(zhuǎn)化，具體結(jié)果如下： （1）建立“抗蚊青占”的再生體系從五種誘導(dǎo)培養(yǎng)基（即1/2N1．5S、1/2NS、N1．5—S、NS、NB）中篩選出添加5．0mg/L Na2S2O3+1．5mg/L2，4—D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基N1

2、．5S，最適合于“抗蚊青占”愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代；添加5．0mg/L KT+0．5mg/L NAA的分化培養(yǎng)基NNK2最適于受試水稻品種的分化． （2）淀粉分支酶基因表達(dá)載體構(gòu)建通過pBlue—pLf8/pBlue—PA2—4/pBlue—pMAⅡ的酶切、電泳、目的片段回收，將克隆在質(zhì)粒pBluescript上的目的基因pLf8/PA2—4/pMAⅡ克隆到亞克隆載體pBBRIMCS上，再克隆到雙元表達(dá)載體pGA1621的相應(yīng)酶切

3、位點(diǎn)上，構(gòu)建出pGA1621—sbe表達(dá)載體。凍融法將表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，雙酶切篩選陽性克隆，獲得含有目的基因的工程菌． （3）遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化確定共培養(yǎng)的最適菌液濃度為OD600=1．1，潮霉素篩選濃度為40mg/L，抑菌劑為提門叮，濃度250 mg/L。將含有pLf8/PA2—4/pMAⅡ工程菌，以抗蚊青占水稻胚性愈傷為材料，進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，GUS組織染色鑒定及PCR鑒定結(jié)果表明，三種基因轉(zhuǎn)化后得