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文檔簡介
1、本研究利用從玉米上克隆的三個淀粉分支酶基因(sbeⅠ,sbeⅡa,sbeⅡb),構建適合水稻轉化的表達載體,建立適合于高直鏈淀粉含量的供試水稻品種“抗蚊青占”的再生體系和農桿菌介導的遺傳轉化體系,并進行SBE基因的遺傳轉化,具體結果如下: (1)建立“抗蚊青占”的再生體系從五種誘導培養(yǎng)基(即1/2N1.5S、1/2NS、N1.5—S、NS、NB)中篩選出添加5.0mg/L Na2S2O3+1.5mg/L2,4—D的誘導培養(yǎng)基N1
2、.5S,最適合于“抗蚊青占”愈傷組織的誘導和繼代;添加5.0mg/L KT+0.5mg/L NAA的分化培養(yǎng)基NNK2最適于受試水稻品種的分化. (2)淀粉分支酶基因表達載體構建通過pBlue—pLf8/pBlue—PA2—4/pBlue—pMAⅡ的酶切、電泳、目的片段回收,將克隆在質粒pBluescript上的目的基因pLf8/PA2—4/pMAⅡ克隆到亞克隆載體pBBRIMCS上,再克隆到雙元表達載體pGA1621的相應酶切
3、位點上,構建出pGA1621—sbe表達載體。凍融法將表達載體導入根癌農桿菌EHA105,雙酶切篩選陽性克隆,獲得含有目的基因的工程菌. (3)遺傳轉化體系的優(yōu)化確定共培養(yǎng)的最適菌液濃度為OD600=1.1,潮霉素篩選濃度為40mg/L,抑菌劑為提門叮,濃度250 mg/L。將含有pLf8/PA2—4/pMAⅡ工程菌,以抗蚊青占水稻胚性愈傷為材料,進行農桿菌介導的遺傳轉化,GUS組織染色鑒定及PCR鑒定結果表明,三種基因轉化后得
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