農桿菌介導的淀粉分支酶基因轉化秈稻的研究.pdf

1、本研究利用從玉米上克隆的三個淀粉分支酶基因（sbeⅠ，sbeⅡa，sbeⅡb），構建適合水稻轉化的表達載體，建立適合于高直鏈淀粉含量的供試水稻品種“抗蚊青占”的再生體系和農桿菌介導的遺傳轉化體系，并進行SBE基因的遺傳轉化，具體結果如下： （1）建立“抗蚊青占”的再生體系從五種誘導培養(yǎng)基（即1/2N1．5S、1/2NS、N1．5—S、NS、NB）中篩選出添加5．0mg/L Na2S2O3+1．5mg/L2，4—D的誘導培養(yǎng)基N1

2、．5S，最適合于“抗蚊青占”愈傷組織的誘導和繼代；添加5．0mg/L KT+0．5mg/L NAA的分化培養(yǎng)基NNK2最適于受試水稻品種的分化． （2）淀粉分支酶基因表達載體構建通過pBlue—pLf8/pBlue—PA2—4/pBlue—pMAⅡ的酶切、電泳、目的片段回收，將克隆在質粒pBluescript上的目的基因pLf8/PA2—4/pMAⅡ克隆到亞克隆載體pBBRIMCS上，再克隆到雙元表達載體pGA1621的相應酶切

3、位點上，構建出pGA1621—sbe表達載體。凍融法將表達載體導入根癌農桿菌EHA105，雙酶切篩選陽性克隆，獲得含有目的基因的工程菌． （3）遺傳轉化體系的優(yōu)化確定共培養(yǎng)的最適菌液濃度為OD600=1．1，潮霉素篩選濃度為40mg/L，抑菌劑為提門叮，濃度250 mg/L。將含有pLf8/PA2—4/pMAⅡ工程菌，以抗蚊青占水稻胚性愈傷為材料，進行農桿菌介導的遺傳轉化，GUS組織染色鑒定及PCR鑒定結果表明，三種基因轉化后得