羊口瘡病毒的分離鑒定及其ELISA檢測方法的建立.pdf

1、羊口瘡又稱羊接觸傳染性膿皰性皮炎,是由羊口瘡病毒引起的綿羊、山羊和某些野生反芻動物的一種常見的接觸性、嗜上皮性傳染病,該病毒也可感染人。羊口瘡病毒屬于痘病毒科副痘病毒屬,該屬病毒還包括牛丘疹性口炎病毒、假牛痘病毒以及紅鹿、松鼠、海豹副痘病毒。羊口瘡呈世界性分布,近年來發(fā)病率逐年上升,引起人們廣泛關注。
　　 羊口瘡病毒基因組由雙鏈線狀DNA組成,大約138kbp,編碼132個假定基因；其中羊口瘡病毒B2L基因編碼約42kDa是具

2、有高免疫原性的主要囊膜蛋白,該蛋白與牛痘病毒主要囊抗原p37K同源。人們已根據(jù)保守的B2L基因進行羊口瘡病毒的檢測,分子特征描述和進化樹分析。隨著羊口瘡流行范圍的日益擴大,亟需建立統(tǒng)一標準的診斷方法,對羊口瘡的流行狀況進行評估,進而為防控羊口瘡提供技術支撐。基于此,本實驗進行了如下研究:
　　 1羊口瘡病毒甘肅株的分離與鑒定
　　 利用HeLa細胞從甘肅某地發(fā)病綿羊痂皮病例中分離羊口瘡病毒；根據(jù)NCBI羊口瘡病毒B2L基

3、因序列,采用Oligo6.0生物軟件設計-對特異性引物,PCR擴增保守B2L基因；運用MEGA4.0.2對獲得羊口瘡病毒株B2L,基因核苷酸序列和其它羊口瘡毒株以及副痘病毒屬其它成員進行多序列比對,最大似然法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結果表明:接種羊口瘡病毒的HeLa細胞在接種后3～4d內產(chǎn)生細胞病變(CPE),表現(xiàn)為細胞聚集、融合、圓縮,直至脫落的特征性病變；用設計的特異性引物對病毒基因組DNA進行PCR擴增,電泳顯示擴增出約1137bp的

4、清晰條帶,與目的基因片段長度一致；與參考序列相似性為99％,提交NCBI獲得登錄號HQ694772;系統(tǒng)發(fā)育進化樹表明分離的羊口瘡病毒屬于Ⅰ支,與羊口瘡病毒吉林分離株親緣關系近。以上結果說明成功分離到羊口瘡病毒,將其命名為Orf-GS株。
　　 2羊口瘡病毒B2L重組蛋白的原核表達及純化
　　 在大腸桿菌Rosetta(DE3)plyS中成功表達了B2L重組蛋白,并對TPTG濃度、誘導時間和溫度等誘導條件進行優(yōu)化,最終確

5、定溫度28℃、IPTG濃度0.4mmol／L、誘導表達4h為B2L融合蛋白的最佳誘導表達條件；由于該蛋白以包涵體的形式表達,采用DOC和SKL對包涵體進行處理,經(jīng)鎳株純化B2L融合蛋白,SAS-PAGE電泳結果表明在42 kDa左右獲得純化目的蛋白；免疫印跡結果分析顯示,該融合蛋白具有良好的免疫反應原性。
　　 3羊口瘡ELISA檢測方法的建立
　　 選用重組B2L蛋白作為包被抗原,探索重組蛋白作為診斷抗原建立間接ELI