胞質動力蛋白與牛皰疹病毒1型相互作用初步研究.pdf

1、牛皰疹病毒1型(BHV-1)屬皰疹病毒科，α皰疹病亞科成員，是有囊膜的雙鏈DNA病毒。病毒粒子由外向里分為4層：囊膜、被膜、衣殼和核酸芯髓。BHV-1基因組總共編碼70個左右基因，其中有10種為糖蛋白，6種為衣殼蛋白，15種為被膜蛋白。在長期的生物進化過程中，α皰疹病毒一直經(jīng)由軸突微管逆行運輸進入核內，最后在神經(jīng)元細胞體建立終身潛伏感染。
　　 胞質動力蛋白由2條重鏈、2條中間鏈、多個輕中間鏈和輕鏈組成，其中重鏈由一個基因編碼，

2、其它部分則由多個基因編碼。已有研究表明，HSV-1和PRV在侵染上皮細胞過程中，動力蛋白會結合其病毒衣殼蛋白進行運輸。但是對BHV-1病毒粒子是否是依賴于微管進入核內沒有報道，同時，BHV-1在運輸?shù)郊毎藘冗^程中，病毒蛋白作用于動力蛋白具體的亞基也是未知的。
　　 因此，本文主要對胞質動力蛋白結合BHV-1病毒粒子進行初步研究，證實病毒進入上皮細胞MDBK時是否依賴于微管，并且試圖找到與BHV-1相互作用的胞質動力蛋白亞基，為

3、精確探究皰疹病毒感染宿主細胞機制奠定基礎。主要工作包括：
　　 1.微管解聚藥物試驗
　　 首先對細胞牛腎傳代細胞(MDBK)進行微管解聚藥物Nocodazole最佳濃度摸索，得到的最適濃度為4μLg/mL，然后采用此濃度藥物作用于MDBK細胞，待藥物作用2h后吸棄并洗凈殘留藥物，用5MOI BHV-1野毒進行感染，在不同的時間點取樣，利用間接免疫熒光對病毒粒子進行細胞內定位觀察。結果顯示微管解聚藥物Nocodazole

4、明顯引起細胞內微管解聚，并且因此影響病毒進入的數(shù)量。為了進一步揭示病毒在藥物影響下增殖情況，我們通過生長曲線實驗，設置3個實驗組，用藥物處理細胞，在不同的時間點收毒，測定病毒PFU進行數(shù)據(jù)分析。結果顯示，藥物的作用延遲了病毒粒子進入到核內的時間；并且在較早的時間內，用藥物處理的細胞中，由于微管的解聚導致重新聚合延遲，病毒粒子的增殖量較低。
　　 2.BHV-1病毒衣殼及被膜蛋白基因的克隆
　　 首先根據(jù)GenBank發(fā)表

5、的BHV-1全基因組序列找到病毒的衣殼及被膜蛋白基因序列，其中衣殼基因6個，被膜基因15個。分析各基因的序列，將較大的基因根據(jù)其抗原位點進行截短，采取分段克隆。根據(jù)序列設計相應的引物，利用BHV-1病毒基因組作為模板，利用PCR擴增片段，回收并連接上pMD-18T載體，酶切驗證并測序。利用生物信息學軟件比對測序結果，得到正確的質粒，再將外源片段連接至pGAD-T7載體以備酵母雙雜交。最后得到正確的質粒包括衣殼基因7個，被膜基因15個。<

6、br>　　 3.酵母雙雜交實驗
　　 將胞質動力蛋白連接pGBK-T7質粒轉化酵母菌AH109并作為釣餌。首先檢測釣餌的自激活，其中Tctex1、Tctex3和C1I1-2連接pGBK-T7質粒轉化后有自激活。將病毒蛋白基因轉化酵母菌Y187，利用酵母GAL4系統(tǒng)進行酵母雙雜交，以SV40/53，SV40/Lam二倍體作為雜交陽性及陰性對照，最后通過篩選189對蛋白得到初步結果，其中輕鏈Robll與被膜蛋白UL51有較弱的相互