甜味蛋白Monellin基因的合成、功能分析及對桑樹的遺傳轉化研究.pdf

1、桑樹(MorusalbaL.)是多年生雙子葉木本植物，也是一種重要的經濟作物。桑樹全身都是寶:桑葉被用作家蠶和畜禽的飼料;桑椹中富含花青素等物質，現已受到越來越多人們的喜愛;桑根、桑皮和桑枝等作為一種傳統(tǒng)藥材，被用到中藥中。隨著科技的發(fā)展，桑樹的價值將得到最大程度的開發(fā)利用，因此，選育新桑品種是研究者的重要任務之一。桑樹的傳統(tǒng)育種，如選擇育種、雜交育種等技術已不能滿足蠶桑產業(yè)向多元化方向發(fā)展的需要，現在越來越多的研究者開始了桑樹的分子育

2、種相關研究。很多研究表明，外源基因對桑樹進行遺傳轉化是可行的，但如何獲得適合的外源基因，提高外源基因的表達量，尋找適合的基因轉化方法等都是需要面對和解決的難點。因此，對桑樹遺傳轉化的研究任重而道遠。
　　 從西非植物Dioscoreophyllumcumminsii的果實中獲得的天然的甜味蛋白Monellin，具有甜度高、熱量低等特點。但它的熱穩(wěn)定性較差，其開發(fā)生產也受到了產地和資源等因素的限制，難以規(guī)?；Ｒ虼?，研究者運用生物

3、技術的方法，合成了甜昧蛋白基因，并在原核與真核表達系統(tǒng)中成功表達，獲得的甜味蛋白在酸性環(huán)境下最高能耐受60℃高溫;在1992年報道了該蛋白在植物中的應用，基因被成功導入萵苣和土豆中，但未能檢測出甜味。
　　 如何能夠提高該蛋白的表達量和熱穩(wěn)定性，如何能夠將monellin基因導入桑樹中并得到表達？本研究圍繞這些問題開展了較為深入系統(tǒng)的研究，并取得了較好的研究結果，現將研究要點總結如下:
　　 1.一個人工設計合成的mon

4、ellin基因
　　 本研究根據已報道的Monellin甜蛋白氨基酸序列，通過統(tǒng)計“各物種密碼子使用頻率數據庫codonusagedatabase”信息，兼顧桑樹與畢赤酵母密碼子的偏愛性，人工設計優(yōu)化了一條長為294bp的單鏈monellin基因，并采用重疊PCR的方法合成該基因。將合成的基因核苷酸序列在NCBI中進行比對，結果顯示這是一個具有新核苷酸序列的monellin基因。我們將這一基因向NCBI進行了提交，確定基因登錄號

5、為GenBank:JQ282905。該基因如能在真核生物和植物的表達系統(tǒng)中表達，則為它擴展應用到其它作物中去提供了新的思路和途徑。
　　 2.新monellin基因的真核表達研究
　　 本研究中，選取巴斯德畢赤酵母GS115為宿主菌，以胞外分泌型的載體pPIC9K為基礎，構建了兩個表達載體pPIC9K-M-E和pPIC9K-M。表達載體pPIC9K-M-E中包含有甜味蛋白monellin基因和綠色熒光蛋白EGFP基因，p

6、PIC9K-M中只包含monellin基因，但它們中均在基因下游帶上了組氨酸標簽以方便蛋白的分離純化。構建好的表達載體經線性化后，采用電擊法轉化入畢赤酵母GS115，經菌落PCR和平板篩選分別獲得了陽性酵母表達菌株GS115/pPIC9K-M和GS115/pPIC9K-M-E，利用含G418的平板篩選出基因多拷貝酵母菌株后，在BMGY和BMMY培養(yǎng)基中利用甲醇誘導獲得了表達上清。然后采用Ni-NTA親和柱純化表達的蛋白，經分析驗證兩種蛋

7、白均有甜味，約為標準蔗糖的500倍，甜味刺激來的慢去的慢;誘導重組菌GS115/pPIC9K-M-E產生的蛋白在熒光顯微鏡下能夠發(fā)出強烈的熒光，誘導重組子GS115/pPIC9K-M獲得的蛋白產物能耐80℃高溫，pH值在3-12之間時，蛋白降解較少。這些結果證明我們獲得的蛋白不但具有甜味，還具有有相對較高的對熱穩(wěn)定性，也有較寬的耐酸堿性。這為它的開發(fā)利用提供了條件。由此，我們將獲得的monellin基因向國家知識產權局申請了國家發(fā)明專利

8、，并于2012年5月獲正式授權，專利號為ZL201010042099.3。該基因的獲得為桑樹及作物遺傳轉化創(chuàng)新了一個有意義的目的基因。
　　 3.利用根癌農桿菌介導法研究monellin基因對桑樹的遺傳轉化
　　 在農桿菌介導法中需要大量的植物受體材料，為了高效獲取組培所需的子葉、下胚軸等外植體，本研究特別探索了一種快速促進桑種子萌發(fā)的方法-振蕩培養(yǎng)法。實驗并分析了靜置培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)2種培養(yǎng)方式處理下，桑種子萌發(fā)狀態(tài)及萌

9、發(fā)過程中內源激素含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化。結果顯示:振蕩培養(yǎng)的桑種子萌發(fā)快而整齊，萌發(fā)率高達99％，比靜置培養(yǎng)分別高9個百分點。經測定，桑種子萌發(fā)過程中振蕩培養(yǎng)組的SOD活性高于靜置培養(yǎng)組。內源激素測定結果顯示，IAA和GA均參與了桑種子的萌發(fā)過程，且相對較低濃度的IAA和較高濃度的GA能促進桑種子的萌發(fā);當GA含量遠高于ABA含量時，能大大促進桑種子的萌發(fā)與幼苗的生長。上述實驗結果表明，振蕩培養(yǎng)比靜置培養(yǎng)方式不僅可以提

10、前2天以上獲得萌發(fā)桑苗，縮短桑樹組培時間，還能減少外植體被真菌等感染的機率。
　　 本研究采用根癌農桿菌介導法和花粉介導法對monellin基因在桑樹中的遺傳轉化進行了研究。實驗中，構建了植物表達載體pCAMBIA2301-M，以“桂優(yōu)62號”、“特優(yōu)2號”、“河南?！焙汀凹瘟?0號”桑樹品種的子葉、下胚軸和叢生芽為遺傳轉化的受體，經基因轉化、誘導培養(yǎng)、生根煉苗等獲得了6株基因轉化苗，其中“嘉陵30號”和“桂優(yōu)62號”各3株。經

11、過實驗發(fā)現，“嘉陵30號”叢生芽和“桂優(yōu)62號”下胚軸是較好的遺傳轉化受體，其中共轉化215個受體材料，經鑒定獲得4株陽性轉化苗，轉化率為1.9％;而以“河南?！钡慕M培外植體作為遺傳轉化受體沒有獲得陽性轉化苗。實驗表明，不同品種資源的桑材料用作轉化受體時，其遺傳轉化效果存在較大差異。實驗也表明根癌農桿菌介導基因轉化桑樹是可行的。
　　 4.利用花粉介導法研究monellin基因對桑樹的遺傳轉化
　　 本研究借鑒研究室李軍