豬流行性腹瀉病毒檢測方法建立及基因變異分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、2010年底開始,豬病毒性腹瀉在我國許多地區(qū)出現暴發(fā)流行,為調查此次腹瀉疫情暴發(fā)的原因,本試驗建立了可同時檢測PEDV、TGEV、GARV和PKV的多重RT-PCR方法,用于臨床腹瀉豬糞便樣本的檢測。為提高對PEDV檢測的靈敏性和建立具有中和保護水平的抗體監(jiān)測方法,本試驗建立了檢測PEDV的巢式RT-PCR方法及基于S蛋白的間接ELISA方法,為臨床上PED流行病學及抗體水平監(jiān)測提供工具。另外,本研究通過對2010~2011年15株PE

2、DV華中地區(qū)毒株M和ORF3基因進行克隆、測序及遺傳進化分析,探討PED在我國再次暴發(fā)的原因。
  1.PEDV、TGEV、GARV和PKV多重RT-PCR檢測方法的建立及臨床應用
  為調查導致此次我國豬腹瀉疫情大面積暴發(fā)原因,本研究建立了可同時檢測PEDV、TGEV、GARV和PKV的多重RT-PCR方法。應用該方法對2010~2012年華中地區(qū)190份腹瀉仔豬樣本進行檢測,PEDV、TGEV、GARV和PKV的陽性率分

3、別為62.11%、0.53%、7.37%和82.11%。其中,PEDV和PKV混合感染率為47.89%,PEDV和GARV混合感染率為4.74%,GARV和PKV混合感染率為7.37%, PEDV、GARV和PKV混合感染率為4.74%,未發(fā)現TGEV與其它3種病毒的混合感染。另外,有27份樣本中僅檢出 PEDV(14.21%),57份樣本只檢出PKV(30%)。結果表明,此次我國大面積暴發(fā)的病毒性腹瀉是多病原混合感染造成的,主要病原為

4、PEDV,PKV在其中所起作用尚待進一步驗證和研究。
  2.PEDV巢式RT-PCR檢測方法的建立及初步應用
  為建立一種靈敏度高的PEDV病原檢測方法,根據GenBank中公布的PEDV M基因序列,分別設計合成針對M基因的內、外2對特異性引物,在優(yōu)化反應條件的基礎上建立了檢測PEDV的巢式RT-PCR方法。結果顯示,單獨使用外引物和內引物建立的常規(guī)RT-PCR方法檢測限量均為50pg的PEDV RNA模板,而使用巢式

5、RT-PCR方法可以檢測到50fg的PEDV RNA模板。另外,該方法對PRRSV、CSFV、TGEV、GARV模板的RT-PCR擴增結果均為陰性。結果表明,建立的巢式RT-PCR方法特異性、敏感性良好,可以準確快速的檢測出樣本中微量的PEDV核酸。
  3.PEDV河南流行毒株S基因部分片段的原核表達及間接ELISA方法的建立
  為建立檢測抗PEDV S蛋白抗體的間接ELISA方法,應用RT-PCR方法擴增PEDV河南流

6、行毒株S基因794bp片段,將其克隆至原核表達載體pET-32a(+),構建pET-32a-S重組質粒并轉化至宿主菌BL21(DE3),在37℃條件下加入IPTG進行誘導表達,經SDS-PAGE分析顯示該蛋白以融合蛋白形式高效表達,分子量約為46.9kD; Western-blot分析表明所表達的重組蛋白具有良好的反應原性。以純化的S蛋白為包被抗原建立檢測PED抗體的間接ELISA方法,試驗確定抗原最佳包被量0.04μg/孔,血清最佳稀

7、釋度為1∶100,HRP-IgG最佳稀釋度為1∶2000,陽性標準判定為OD450≥0.24。應用該方法對河南省不同地區(qū)23家豬場的279份血清樣本進行檢測,結果顯示,母豬血清樣本PED抗體陽性率為97.42%(227/233);育肥和保育豬血清樣本陽性率為71.74%(33/46)。結果表明,所建立的間接ELISA方法特異性、靈敏性和可重復性良好,可以用于豬群PED抗體水平監(jiān)測和流行病學調查。
  4.2010~2011年華中地

8、區(qū)PEDV流行毒株基因變異分析
  為研究PED再次在中國中部的暴發(fā)原因,對2010年10月至2011年12月之間收集于華中地區(qū)的15株PEDV流行毒株M和ORF3基因進行RT-PCR擴增、克隆、測序及分析。序列分析顯示PEDV華中地區(qū)毒株M和ORF3基因有些核苷酸及氨基酸發(fā)生改變;基于M和ORF3基因的遺傳進化分析顯示,PEDV可以分為3個群(G1,G2,G3),15株PEDV華中地區(qū)毒株均屬于第3群,與2007年韓國株、200

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