15391.羧酸酯酶基因的克隆表達及其應用_第1頁
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1、分類號：——UDC——密級：盟編號：羧酸酯酶基因的克隆表達及其應用Cloning&ExpressionandApplicationofCarboxylesteraseGene學位授予單位及代碼：基查理王盔堂!!Q!晝魚2學科專業(yè)名稱及代碼：玉扭絲堂(QZQ圣Q12研究方向：玉扭生塑麴苤撾抖申請學位級別：亟指導教師：王遮坐塾援研究生：圃』!蟲論文起止時間：201110一201212摘要本文實現(xiàn)了小鼠肝臟羧酸酯酶的基因克隆表達，并對重組酶的

2、酶學性質和降解作用進行研究。提取小鼠肝臟總RNA經反轉錄PCR克隆羧酸酯酶基因(ceslf)，與pUCmT載體連接，構建克隆載體pUCmTceslf。測序正確后，將ceslf亞克隆至表達載體pET32a連接，構建重組表達質粒pET32aceslf，轉化到宿主菌BL21(DE3)后經IPTG誘導表達，SDSPAGE電泳結果顯示出分子質量約為77KD的特異性條帶，但主要以包涵體形式存在。優(yōu)化表達條件，確定最優(yōu)條件為：pH65，20℃培養(yǎng)，轉

3、接量3：200，IPTG終濃度06mM，誘導8h。采用Ni柱對表達產物進行純化，純化后的可溶性蛋白酶比活為5537U／mg，純化回收率為478％。分別以洳乙酸萘酯和B乙酸萘酯作為底物測定重組羧酸酯酶的Km值分別為：006125mM和01334mM，確定最適底物為渺乙酸萘酯。重組酶最適溫度為27℃，最適pH在60到80之間。利用重組酶對農藥進行降解實驗，經HPLC檢測發(fā)現(xiàn)對西維因、呋喃丹、甲基對硫磷及聯(lián)苯菊酯等具有降解作用，為環(huán)境中農藥殘

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