家蠶表達霍亂毒素B亞基與人胰島素或胰島素B鏈融合蛋白及其抗自身免疫性糖尿病的研究.pdf

1、Ⅰ型糖尿病由胰島素分泌缺陷產生，它是一種針對胰島β細胞的自身免疫性疫病。在疾病發(fā)展過程中，胰島素及其前體、谷氨酸脫羧酶(GAD)、熱休克蛋白(HSP60)等多種自身抗原被T細胞識別，產生自身免疫反應并導致胰島損傷。動物實驗表明通過口服一種自身抗原，如胰島素或GAD，即誘導了免疫耐受，產生了保護作用，進而抑制糖尿病的發(fā)生。 1.口服家蠶表達CTB與胰島素融合蛋白對治療自身免疫性糖尿病的研究 口服疾病特異性自身抗原能誘導口服

2、免疫耐受，并能有效延緩或抑制自身免疫性疾病癥狀的發(fā)生。在體內成功誘導免疫耐受需要長期口服大量的蛋白抗原，霍亂毒素B亞基(CTB)可作為誘導口服耐受的強大粘膜運載系統(tǒng)，自身抗原通過與CTB蛋白偶聯(lián)可極大地較少口服自身抗原的劑量。這些都暗示CTB偶聯(lián)自身抗原不僅使口服耐受防治Ⅰ型糖尿病等自身免疫性疫病更具有實際應用價值，而且還有潛在的治療前景。 在本研究中我們構建了CTB與人胰島素融合基因，并在家蠶中得到高效表達，融合蛋白(20kD

3、a)在家蠶幼蟲的蠶血淋巴中表達量達到0.3mg/ml。經檢測，該融合蛋白在家蠶中以五聚體形式存在，并且保持GM1神經節(jié)苷脂的受體結合特性以及CTB和胰島素的抗原性。非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠經口服含微克級的CTB與胰島素融合蛋白的蠶血淋巴，病理組織切片實驗表明胰島發(fā)炎程度顯著減輕。適時監(jiān)測血糖的實驗結果亦表明糖尿病的病理癥狀得到明顯延緩，過繼轉移實驗亦表明口服該融合蛋白產生了潛在的調節(jié)性T細胞從而抑制糖尿病的發(fā)生。這些結果表明家蠶生物

4、反應器是一個合適的生產口服疫苗系統(tǒng)，并通過該系統(tǒng)誘導針對T細胞介導的自身免疫疾病的免疫耐受，該研究是利用我國自身蠶業(yè)資源優(yōu)勢研制抗Ⅰ型糖尿病口服疫苗，為Ⅰ型糖尿病的治療開辟了新的途徑。 2.部分多角體同源序列對外源基因在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達的影響分析 目前家蠶桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(BEVS)已被廣泛用來高效表達外源基因，但在很多情況下，昆蟲細胞或幼蟲表達的重組蛋白量不夠，不能滿足實驗需要。因此，需要一些新的技術和方法來

5、提高外源蛋白在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達水平。 本研究在CTB與胰島素融合基因(CTB-INS)的5’端融合了部分來自多角體基因的5’非編碼區(qū)(ATAAAT)和編碼區(qū)(ATGCCGAAT)共15bp的核酸序列，因此與原CTB-INS融合蛋白相比，經過修飾的融合蛋白(mCTB-INS)在其N末端增加了兩個氨基酸Pro-Asn。我們將新的融合蛋白mCTB-INS在家蠶細胞和幼蟲中分別表達，結果發(fā)現(xiàn)由于融合了部分多角體同源序列(PPHS)，

6、新的蛋白的表達量與原CTB-INS蛋白相比提高了近4倍。進一步分析得知，新蛋白N端增加的兩個氨基酸并未顯著影響其與GM1神經節(jié)苷脂的結合能力。因此，本實驗中所使用的15bp多角體同源序列可被用作為一個結構元件，在多角體啟動子下游促進外源基因的表達。 3.口服家蠶表達CTB與胰島素B鏈融合蛋白對治療糖尿病的研究 選擇胰島素B鏈作為自身抗原是由于B鏈包含了胰島素的主要抗原決定族，而這些抗原決定族與自身免疫性糖尿病的發(fā)展極其相

7、關，僅僅口服胰島素B鏈在動物模型中同樣能抑制糖尿病的發(fā)生，其效果與口服胰島素完整蛋白相近。 在本研究中我們構建了CTB與人胰島素B鏈融合基因，并在家蠶中得到高效表達，融合蛋白(17kDa)在家蠶幼蟲的蠶血淋巴中表達量達到0.97毫克/毫升。經檢測，該融合蛋白在家蠶中以五聚體形式存在，并且保持GM1神經節(jié)苷脂的受體結合特性以及CTB的抗原性。非肥胖性糖尿病小鼠經口服含微克級的CTB與胰島素B鏈融合蛋白的蠶血淋巴，病理組織切片實驗表