miR-36f對豬蛔蟲幼蟲發(fā)育的調控及其靶基因核酸疫苗免疫效果評價.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、豬蛔蟲(Ascaris suum)在分類上屬于蛔蟲目(Ascaridida),蛔蟲科(Ascarididae),蛔蟲屬(Ascaris),成蟲寄生于豬的小腸,是豬腸道中最大的寄生線蟲,呈世界性分布。就豬蛔蟲的危害而言,一方面,豬蛔蟲寄生消耗宿主營養(yǎng),數(shù)量巨大時導致腸道堵塞;另一方面,豬蛔蟲幼蟲移行會對宿主器官造成機械性損傷。雖然化學藥物可以實現(xiàn)蛔蟲病治療,但由于長期對藥物的依賴以及不科學地使用,也造成了寄生蟲抗藥性的產生以及動物產品藥物

2、殘留問題。隨著人們對環(huán)境保護和食品健康的要求和關注度越來越高,開發(fā)新的、環(huán)境友好型、無殘留抗寄生蟲藥物越發(fā)顯重要。
  MicroRNA(miRNA)是細胞內一類非編碼小分子 RNA,在轉錄后水平上調控基因的表達。研究已經證實,miRNA作為轉錄后調控因子在調節(jié)寄生蟲發(fā)育方面有著不可或缺的作用,提示我們可以從miRNA角度出發(fā),尋找防控寄生蟲的新方法。DNA疫苗又稱裸DNA疫苗,是將具有抗原性的蛋白基因克隆到真核表達載體,然后將此

3、重組的DNA通過注射等方式導入機體內,在機體內表達抗原蛋白,使機體獲得免疫保護的一種新型疫苗。由于DNA疫苗不僅能夠刺激機體產生體液免疫應答,還能像減毒活疫苗一樣誘導機體產生細胞免疫,并且其安全性良好,所以近年來越來越受到研究者的關注。
  有鑒于此,本論文工作開展了以下兩方面的工作:
  1.初步評價了asu-miR-36f對豬蛔蟲幼蟲發(fā)育及感染性的影響。
  本實驗室前期通過對豬蛔蟲發(fā)育史miRNA表達譜分析發(fā)現(xiàn)a

4、su-miR-36f只在豬蛔蟲的卵和幼蟲期特異表達,而在其他時期不表達,表明此miRNA在豬蛔蟲的早期發(fā)育可能有重要作用。因此,設計合成了 miRNA模擬物(mimics)和抑制劑(inhibitor),并通過浸泡的方法來導入幼蟲體內,檢測asu-miR-36f以及其兩個關鍵靶基因(OST48和Cyb)的表達量;然后將處理過的幼蟲感染小鼠并進行了幼蟲回收和計數(shù),初步探討其對豬蛔蟲幼蟲發(fā)育和感染性的影響。結果發(fā)現(xiàn):跟對照相比,抑制劑組回收

5、幼蟲的數(shù)量、長度和寬度差異顯著,可能是由于在抑制劑的作用下,asu-miR-36f在幼蟲體內的水平下降,對某些靶基因的抑制作用減弱,從而對某些通路產生了影響,進而對幼蟲的發(fā)育產生了影響。經過模擬物處理實驗組的回收幼蟲的數(shù)量、回收蟲體的長度和寬度與其他對照組相比差異不顯著,提示蟲體內的miRNA功能的發(fā)揮可能依賴一定的閾值限制,當miRNA的水平高于這個閾值的時候,隨著miRNA水平的升高,miRNA的功能不再明顯加強。本實驗同時證明通過

6、浸泡的方法可以有效地將miRNA導入到線蟲體內。與基因槍、顯微注射等方法相比,此方法有簡單易行,對蟲體損傷小等優(yōu)點。
  2.構建pVAX-AG、pVAX-NCS核酸疫苗,評價其免疫效果。
  通過生物信息學分析,我們在眾多asu-miR-36f的靶基因中選擇了兩個豬蛔蟲特有的靶基因。將這兩個靶基因,通過 PCR克隆、酶切、連接 pET30a質粒、轉化 DH5α、測序驗證,并進行BL21(DE3)原核表達后制備小鼠免疫多抗,

7、在此基礎上構建了pVAX1.0重組質粒,并通過間接免疫熒光法、Western blot證實了構建的兩個真核重組質粒能夠在真核細胞表達,隨后進行質粒大量制備,通過注射方法免疫小鼠,檢測抗體水平、細胞因子水平、攻蟲實驗等指標檢測了小鼠血清中IgG抗體及IgG1、IgG2a抗體亞類、CD3+CD4+CD8-和CD3+CD8+CD4-細胞含量、細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、和IL-10等,綜合評價了構建的DNA疫苗的免疫保護性作用。結

8、果表明:pVAX-NCS可以有效地誘導實驗小鼠產生體液免疫應答和細胞免疫應答,最終的減蟲率達35.96%;而pVAX-AG也可以引起實驗小鼠產生體液免疫應答和細胞免疫應答,但是較弱,實驗組的減蟲率也不及pVAX-NCS組。提示pVAX-NCS對小鼠具有較好的免疫保護作用。
  綜上所述,本研究初步評價了 asu-miR-36f對豬蛔蟲幼蟲發(fā)育的影響,并利用其靶基因成功構建了DNA疫苗,為豬蛔蟲DNA疫苗的研究奠定了基礎。同時,因為

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