溶血卵磷脂?；D移酶1缺陷小鼠視網膜變性和基因治療的研究.pdf

1、第一部分:溶血卵磷脂?；D移酶1缺陷對小鼠視網膜組織和視網膜電圖的影響
　　目的：觀察溶血卵磷脂?；D移酶1缺陷(LPCAT1)小鼠視網膜組織結構和視網膜電圖（F-ERG）在變性過程中的變化。
　　方法：Lpcat1基因自發(fā)突變純合子的rd11小鼠作為實驗組，選取出生后14、28、42和56d的小鼠共60只;同齡野生型C57BL/6J小鼠（60只）作為對照。上述4個年齡段的兩組小鼠，行視網膜石蠟切片HE染色觀察視網膜顯微結構

2、;行F-ERG檢測，記錄暗視桿體反應和明視錐體反應。運用視網膜鋪片免疫熒光染色法，觀察兩組小鼠視錐細胞M-和S-視蛋白的表達分布及變化。
　　結果：光學顯微鏡觀察發(fā)現:實驗組小鼠視網膜組織結構隨鼠齡增長光感受器細胞層逐漸減少，而對照組視網膜組織結構基本正常。F-ERG實驗結果顯示:實驗組小鼠出生后14、28 d暗視桿體反應存在，呈下降趨勢，出生后42和56 d，暗視桿體反應消失，對照組各時間點暗視桿體反應正常;出生后14d，實驗組

3、和對照組小鼠b波振幅分別為(72.8±15.6)、（105.2±21.1）μV，實驗組較對照組降低，差異有統計學意義(t=-2.760，P＜0.05);出生后28 d時，實驗組和對照組小鼠b波幅值分別為（20.6±6.4）、（231.8±32.0）μV，實驗組較對照組明顯降低，差異有統計學意義（t=-14.471，P＜0.05）。實驗組小鼠出生后14、28和42 d明視錐體反應存在，呈降低趨勢，出生后56 d明視錐體反應消失，對照組各時

4、間點明視錐體反應正常;出生后14d，實驗組和對照組小鼠b波振幅分別為（46.8±7.2）、（42.8±6.4）μV，兩組相比，差異無統計學意義;出生后28和42 d，實驗組小鼠b波振幅分別為（78.0±8.2）、（17.2±2.0）μV，對照組小鼠b波振幅分別為（91.4±9.4）、（116.2±12.9）μV，實驗組較對照組明顯降低，差異有統計學意義（t=-2.401、-17.008，P均＜0.05）。視網膜鋪片免疫熒光染色結果顯示:

5、實驗組小鼠視網膜錐細胞M-和S-視蛋白表達密度隨鼠齡增長逐漸下降，到出生后42 d，實驗組小鼠視網膜大部分區(qū)域M-視蛋白和S-視蛋白表達消失，而對照組未見明顯變化。出生后28 d，實驗組小鼠視網膜后極部顳上、顳下、鼻上、鼻下區(qū)域M-視蛋白的表達密度分別為(414±32)、(300±8)、（324±22）和（250±20）個/0.037mm2，與同齡對照組（484±21）、（442±19）、（459±34）和（436±12）個/0.037

6、 mm2相比，差異均有統計學意義（t=4.114、15.225、7.505、17.990， P均＜0.05）;上述4個區(qū)域S-視蛋白的表達密度下降更明顯，分別為（8±4）、（175±16）、（74±13）、（315±20）個/0.037 mm2，明顯低于對照組（73±16）、（436±30）、（393±30）和（480±19）個/0.037 mm2，差異均有統計學意義（t=8.555、17.076、21.637、13.498，P均＜0.

7、05）。
　　結論： LPCAT1缺陷主要影響小鼠視網膜外層光感受器細胞，視桿系統功能下降早于視錐系統，錐細胞S-視蛋白的消失早于M-視蛋白。
　　第二部分:腺相關病毒載體介導Lpcat1基因治療rd11小鼠視網膜變性的研究
　　目的：rd11小鼠是近年來新發(fā)現的視網膜變性動物模型(Lpcat1基因自發(fā)突變純合子)，目前對其的治療研究并未有見報道。為了驗證這種視網膜變性基因治療的可行性，我們以酪氨酸突變的腺相關病毒(A

8、AV)作為轉基因載體，觀察其能否挽救視網膜結構及功能。
　　方法：將AAV8(Y733F)-smCBA-Lpcat1注射至60只出生后14 d的rd11小鼠一只眼視網膜下腔，對側眼不注射作為陰性對照。分別檢測治療后4、7和10周rd11小鼠視網膜電圖(F-ERG)，并通過水迷宮實驗檢測視行為。最后對小鼠眼球進行HE染色、免疫熒光染色、視網膜鋪片，觀察視網膜結構及LPCAT1蛋白和錐細胞視蛋白的表達情況。實驗中均選擇同齡野生型C57

9、BL/6J小鼠作為陽性對照。
　　結果：AAV8(Y733F)介導Lpcat1基因的表達可以有效恢復視網膜結構和功能，療效可維持10周以上。治療后10周，rd11小鼠治療眼F-ERG最大混合反應、暗視桿體反應和明視錐體反應b波振幅分別為（417.3±63.8）、（208.3±31.5）和（68.7±8.5）μV，與未治療眼(14.9±10.9μV、5.4±4.6μV和6.0±6.5μV)和同齡野生型C57BL/6J小鼠(659.7

10、±47.2μV、314.0±44.1μV和109.0±7.5μV)相比差異均有統計學意義（P均＜0.05）。而反映視錐、視桿細胞敏感度的b波峰時，治療眼與同齡野生型C57BL/6J小鼠間無明顯差異;HE染色結果顯示rd11小鼠治療眼視網膜外核層厚度達6～7層，較未治療眼明顯變厚;免疫熒光染色可檢測到治療眼視網膜中LPCAT1蛋白陽性表達，錐細胞M-和S-視蛋白的表達恢復，而未治療眼均呈陰性表達;水迷宮實驗顯示rd11小鼠治療眼和對側未治