肝癌細胞多熒光EMT指示模型的構建及功能初探.pdf

1、背景:惡性腫瘤是一類嚴重威脅人類健康的疾病,而在所有的惡性腫瘤中,原發(fā)性肝癌(Hepatpocellular carcinoma,HCC)所占比例超過5％,位于惡性腫瘤總致死原因的第五位。和其他惡性腫瘤一樣,肝癌的復發(fā)轉移是其治療失敗的主要原因。
　　 在腫瘤的轉移過程中,EMT(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)所表現(xiàn)出的細胞學機制即細胞粘附性的喪失和遷移能力的獲得作為腫瘤轉移級聯(lián)反應

2、的關鍵環(huán)節(jié)已越來越受到學者們的關注。其最主要特征為上皮細胞標記蛋白E-cadherin表達降低,而間質標記蛋白表達上調。近來,已有相當多的證據(jù)表明,EMT是肝癌轉移的關鍵事件,其在肝癌的侵襲轉移過程中發(fā)揮著極其重要的作用。因此,如何動態(tài)監(jiān)測肝癌細胞的EMT事件,對進一步剖析其機理,進而開發(fā)針對性治療策略變得至關重要。
　　 熒光蛋白報告基因由于其異源細胞中表達穩(wěn)定,不需要其他輔助因子參加,易于檢測,無細胞毒性,且可利用不同熒光蛋

3、白組合對細胞進行多重標記等優(yōu)勢,已成為構建指示報告系統(tǒng)的首選對象。而慢病毒載體作為目前被認為的最有效的理想基因轉移載體之一,對分裂細胞和非分裂細胞均具有很好的感染能力,免疫反應小且無毒性,可以將外源基因有效地整合到宿主基因組上,從而達到穩(wěn)定持久表達等特點,已廣泛應用于基因治療、科學研究等領域。因而構建基于慢病毒表達系統(tǒng)的EMT熒光指示模型具有很好的基礎及臨床意義。
　　 目標:構建基于慢病毒表達系統(tǒng)的、EMT相關標志物E-cad

4、herin、Slug啟動子驅動的熒光報告系統(tǒng),為下一步標記示蹤肝癌EMT細胞,動態(tài)顯示肝癌細胞的EMT過程,建立體外肝癌細胞EMT誘導模型打下基礎。
　　 方法:從Hela細胞基因組中擴增出E-cadherin及Slug啟動子,并分別與紅、黃、藍三種熒光蛋白相連,然后克隆入慢病毒載體質粒中,獲得E-cadherin及Slug啟動子分別攜帶三種熒光蛋白的慢病毒載體:Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP和Lv-pSlug-RF

5、P/YFP/BFP。采用磷酸鈣法將慢病毒表達質粒和包裝質粒共轉染293FT細胞,生產包裝得到病毒。進而以收獲的Lv-pE-cad-YFP病毒感染人肝癌細胞PLC/PRF/5,并經流式分選得到YFP表達陽性和陰性的細胞,通過qRT-PCR,western blotting等技術檢測病毒的有效性。
　　 結果:經酶切、測序等方法證實E-cadherin及Slug啟動子驅動的多熒光報告基因載體構建成功。采用磷酸鈣轉染法成功包裝出病毒。