人非小細(xì)胞肺癌相關(guān)游離蛋白的研究.pdf

1、研究背景
　　 目前，肺癌已經(jīng)成為我國(guó)死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌的早期診斷是保證臨床治療成功和提高生存率的關(guān)鍵一步。外周血血漿中含有全身組織來(lái)源的蛋白，機(jī)體器官的病理改變可表現(xiàn)為血漿蛋白在結(jié)構(gòu)和數(shù)量上的改變。這類特征性的變化有可能作為微創(chuàng)傷性實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的指標(biāo)，對(duì)于疾病（包括腫瘤）的診斷和治療均具有十分重要的意義。
　　 研究目的
　　 本項(xiàng)研究旨在發(fā)現(xiàn)鑒定外周血血漿中與人非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的標(biāo)志性蛋白，遠(yuǎn)

2、期目標(biāo)為建立肺癌相關(guān)的的血漿蛋白聯(lián)合檢測(cè)模型，以輔助臨床診斷及療效監(jiān)測(cè)。
　　 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
　　 采用本實(shí)驗(yàn)室前期工作構(gòu)建的體液中腫瘤相關(guān)蛋白研究體系，針對(duì)9例非小細(xì)胞肺癌病人的腫瘤及對(duì)照組織樣品建立原代培養(yǎng)，收集其條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM）。隨后采用液相色譜和線性離子阱質(zhì)譜（Linear iontrap，LTO）對(duì)條件培養(yǎng)基樣品的總蛋白進(jìn)行分離和全譜鑒定。繼而采用BRBarraytools、

3、ArraySVG等軟件，以無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)譜數(shù)（spectral count）為定量參數(shù)分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)。分別通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)類比分析兩種策略進(jìn)行游離蛋白數(shù)據(jù)的信息挖掘，以此獲得重要的肺癌相關(guān)血漿標(biāo)志蛋白；然后分別以ELISA、Western blot和免疫組化方法在血漿和組織樣品中進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 通過(guò)質(zhì)譜鑒定共得到987個(gè)高可信度的蛋白，初步建立了肺癌相關(guān)游離蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)；

4、生物功能分類提示這些蛋白在15個(gè)生物學(xué)過(guò)程中富集，其中包括蛋白結(jié)合（protein binding）、水解酶活性（hydrolase activity）、鈣離子結(jié)合（calcium ionbinding）、細(xì)胞骨架結(jié)合（cytoskeletal protein binding）等過(guò)程。經(jīng)微陣列顯著性分析（Significance analysis of microarrays，SAM）運(yùn)算得到143個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中78個(gè)在腫瘤組織培

5、養(yǎng)基中豐度升高（包括目前臨床上用于輔助肺癌診斷的血清腫瘤標(biāo)志物Cyfra21-1和SCC，65個(gè)在腫瘤組織培養(yǎng)基中豐度降低。GeneOntology富集分析結(jié)果顯示，在腫瘤組織培養(yǎng)基中豐度升高的蛋白主要參與細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)及糖酵解等途徑，其中糖酵解途徑中6個(gè)關(guān)鍵性的催化酶（ALDOC、TPI1、ENO1、ENO2、GAPDH、PGK1和PK）在腫瘤組織培養(yǎng)基中均顯著上調(diào)。針對(duì)差異蛋白的Network分析顯示，ENO1屬于“連線”較多的

6、蛋白之一。根據(jù)以上結(jié)果，選擇ENO1、ALCAM、CLU和DCN分別采用ELISA和免疫組化方法對(duì)血漿和組織樣品進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在組織水平，相對(duì)于配對(duì)癌旁肺組織，ENO1在腫瘤中的表達(dá)顯著升高，ALCAM、CLU、DCN的表達(dá)顯著降低，其中細(xì)胞膜中ALCAM的表達(dá)與肺腺癌的臨床分期負(fù)相關(guān)；肺癌病人血漿中ENO1的蛋白濃度顯著高于良性肺部疾患者和健康獻(xiàn)血者，而肺癌病人血漿中ALCAM的蛋白濃度則較良性肺部疾患者和健康獻(xiàn)血者顯著降低。

7、
　　 此外，針對(duì)從上述建立原代培養(yǎng)的9例肺癌組織中的2例以上條件培養(yǎng)基樣品鑒定到的511個(gè)高可信度蛋白，使用GSEA-P軟件分析后發(fā)現(xiàn)，與人足月分娩胎盤RNA表達(dá)譜比對(duì)，來(lái)自肺癌條件培養(yǎng)基的197個(gè)蛋白在侵襲性較強(qiáng)的中期胎盤母胎界面表達(dá)譜中有顯著的富集。進(jìn)而挑選了其中的MMP-1和LGALS3分別進(jìn)行血漿和組織水平的驗(yàn)證。結(jié)果顯示，腫瘤組織及血漿中MMP-1的水平隨著肺癌進(jìn)展均顯著升高，并可預(yù)示肺癌病人的不良預(yù)后；腫瘤細(xì)胞LG

8、ALS3的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，而腫瘤組織間質(zhì)LGALS3的表達(dá)與肺鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。從而證實(shí)這種富集方法得到的蛋白與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法對(duì)鑒定體液中惡性腫瘤相關(guān)的蛋白標(biāo)志物具有潛在應(yīng)用價(jià)值。胚胎植入與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為有很大的相似性，發(fā)育生物學(xué)提供的信息有助于詮釋腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移--因而，從系統(tǒng)生物學(xué)的角度將類似的生物學(xué)行為以及不同分子水平的分