人非小細胞肺癌相關游離蛋白的研究.pdf

1、研究背景
　　 目前，肺癌已經成為我國死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌的早期診斷是保證臨床治療成功和提高生存率的關鍵一步。外周血血漿中含有全身組織來源的蛋白，機體器官的病理改變可表現(xiàn)為血漿蛋白在結構和數量上的改變。這類特征性的變化有可能作為微創(chuàng)傷性實時監(jiān)測的指標，對于疾?。ò[瘤）的診斷和治療均具有十分重要的意義。
　　 研究目的
　　 本項研究旨在發(fā)現(xiàn)鑒定外周血血漿中與人非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關的標志性蛋白，遠

2、期目標為建立肺癌相關的的血漿蛋白聯(lián)合檢測模型，以輔助臨床診斷及療效監(jiān)測。
　　 實驗設計
　　 采用本實驗室前期工作構建的體液中腫瘤相關蛋白研究體系，針對9例非小細胞肺癌病人的腫瘤及對照組織樣品建立原代培養(yǎng)，收集其條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM）。隨后采用液相色譜和線性離子阱質譜（Linear iontrap，LTO）對條件培養(yǎng)基樣品的總蛋白進行分離和全譜鑒定。繼而采用BRBarraytools、

3、ArraySVG等軟件，以無標記定量蛋白質組學方法產生的蛋白質譜數（spectral count）為定量參數分析質譜數據。分別通過比較蛋白質組學和系統(tǒng)生物學類比分析兩種策略進行游離蛋白數據的信息挖掘，以此獲得重要的肺癌相關血漿標志蛋白；然后分別以ELISA、Western blot和免疫組化方法在血漿和組織樣品中進行驗證。
　　 實驗結果
　　 通過質譜鑒定共得到987個高可信度的蛋白，初步建立了肺癌相關游離蛋白數據庫；

4、生物功能分類提示這些蛋白在15個生物學過程中富集，其中包括蛋白結合（protein binding）、水解酶活性（hydrolase activity）、鈣離子結合（calcium ionbinding）、細胞骨架結合（cytoskeletal protein binding）等過程。經微陣列顯著性分析（Significance analysis of microarrays，SAM）運算得到143個差異表達蛋白，其中78個在腫瘤組織培

5、養(yǎng)基中豐度升高（包括目前臨床上用于輔助肺癌診斷的血清腫瘤標志物Cyfra21-1和SCC，65個在腫瘤組織培養(yǎng)基中豐度降低。GeneOntology富集分析結果顯示，在腫瘤組織培養(yǎng)基中豐度升高的蛋白主要參與細胞的氧化還原反應及糖酵解等途徑，其中糖酵解途徑中6個關鍵性的催化酶（ALDOC、TPI1、ENO1、ENO2、GAPDH、PGK1和PK）在腫瘤組織培養(yǎng)基中均顯著上調。針對差異蛋白的Network分析顯示，ENO1屬于“連線”較多的

6、蛋白之一。根據以上結果，選擇ENO1、ALCAM、CLU和DCN分別采用ELISA和免疫組化方法對血漿和組織樣品進行了驗證。結果顯示，在組織水平，相對于配對癌旁肺組織，ENO1在腫瘤中的表達顯著升高，ALCAM、CLU、DCN的表達顯著降低，其中細胞膜中ALCAM的表達與肺腺癌的臨床分期負相關；肺癌病人血漿中ENO1的蛋白濃度顯著高于良性肺部疾患者和健康獻血者，而肺癌病人血漿中ALCAM的蛋白濃度則較良性肺部疾患者和健康獻血者顯著降低。

7、
　　 此外，針對從上述建立原代培養(yǎng)的9例肺癌組織中的2例以上條件培養(yǎng)基樣品鑒定到的511個高可信度蛋白，使用GSEA-P軟件分析后發(fā)現(xiàn)，與人足月分娩胎盤RNA表達譜比對，來自肺癌條件培養(yǎng)基的197個蛋白在侵襲性較強的中期胎盤母胎界面表達譜中有顯著的富集。進而挑選了其中的MMP-1和LGALS3分別進行血漿和組織水平的驗證。結果顯示，腫瘤組織及血漿中MMP-1的水平隨著肺癌進展均顯著升高，并可預示肺癌病人的不良預后；腫瘤細胞LG

8、ALS3的表達與非小細胞肺癌的淋巴結轉移正相關，而腫瘤組織間質LGALS3的表達與肺鱗癌的淋巴結轉移正相關。從而證實這種富集方法得到的蛋白與腫瘤的侵襲轉移密切相關。
　　 結論
　　 無標記定量蛋白質組學分析方法對鑒定體液中惡性腫瘤相關的蛋白標志物具有潛在應用價值。胚胎植入與腫瘤侵襲轉移生物學行為有很大的相似性，發(fā)育生物學提供的信息有助于詮釋腫瘤的侵襲轉移--因而，從系統(tǒng)生物學的角度將類似的生物學行為以及不同分子水平的分