Th17細胞在銀屑病發(fā)病機制中的作用及復方甘草酸苷對HaCaT細胞增殖和相關(guān)因子表達的研究.pdf

1、目的:通過銀屑病的動物模型，檢測皮膚組織中Th17、IL-6、TNF-α和PGE2等細胞因子的含量，應用Western blot技術(shù)檢測皮膚組織中MMP-1和MMP-3的含量，觀察復方甘草酸苷對HaCaT細胞增殖和相關(guān)因子表達的影響，以探討Th17細胞在銀屑病發(fā)病機制中的作用及復方甘草酸苷治療銀屑病的機制，為復方甘草酸苷治療銀屑病提供可靠的實驗依據(jù)和理論支撐。
　　方法:1、體內(nèi)試驗:取新西蘭大白兔24只，隨機分為正常組、模型組、

2、治療組、對照組。采用根據(jù)HULTH的造模方法進行家兔銀屑病模型的造模處理，在造模成功的1周之后按照設(shè)定好的實驗方案對家兔給藥，通過連續(xù)性給藥6周之后，對家兔銀屑病的皮膚病理學形態(tài)及相關(guān)炎性細胞因子進行檢查，以了解相關(guān)的變化情況。(1)對造模及用藥后的皮膚組織進行收集，切片制作標本，通過顯微鏡觀察其皮膚組織及細胞的形態(tài)學變化情況，對皮膚病理的結(jié)構(gòu)進行觀察。(2)通過皮膚組織的收集，觀察皮膚組織的外觀性狀。(3)采用ELISA法檢測皮膚組織

3、中Th17、IL-6、TNF-α和PGE2的含量。(4)運用Western blot檢測皮膚組織中MMP-1和MMP-3的蛋白含量。
　　2、體外實驗:(1)復方甘草酸苷促進HaCaT細胞生長的實驗研究:取角朊細胞的體外培養(yǎng)模型(HaCaT)進行體外的細胞實驗，通過體外3代的HaCaT細胞的培養(yǎng)作為實驗用，對HaCaT細胞進行分組觀察，隨機分為對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組(分別為含有復方甘草酸苷濃度為0ug/L、25ug/

4、L、50ug/L、100ug/L的10％FBS DMEM)。干預72h后使用流式細胞儀檢測HaCaT細胞周期分布，分析G0/G1、S及G2/M期的細胞數(shù)量。并采用western-blot技術(shù)測定細胞中cyclinD1、CDK4、p21蛋白的表達。(2)復方甘草酸苷抑制HaCaT細胞調(diào)亡的實驗研究:采用第3代HaCaT細胞作為實驗用細胞并隨機分為高劑量、低劑量、中劑量和對照組及不加藥的模型組，其中正常的組織加含胎牛血清的10％的培養(yǎng)基進行

5、培養(yǎng)，其余各組均加入含有1mmol/L的的10％FBS DMEM干預24h后加入，相應濃度的藥物同樣也干預24h，通過電子顯微鏡對HaCaT細胞的組織形態(tài)及變化特點進行收集，再通過流式細胞儀檢查HaCaT細胞的凋亡情況。蛋白的檢測采用Western-Blot的檢測方法，指標包括Bcl-2、Bax、NF-κB。通過比色法檢測HaCaT細胞的凋亡因子的表達，指標有Caspase-3、Caspase-9。檢測皮膚組織中炎性因子表達的情況，指標

6、包括Th17、IL-6、TNF-α和PGE2。
　　結(jié)果:1、體內(nèi)實驗結(jié)果:觀察家兔的皮膚組織切片，空白組在體實驗可以看到其皮膚組織表面是光滑的，其組織細胞的排列整齊其分布均勻。而模型組的組織結(jié)構(gòu)受到一定的破壞，出現(xiàn)變薄的現(xiàn)象，細胞排列雜亂，個別地方可見組織表層消失的現(xiàn)象;而治療組和對照組皮膚組織損傷有所減輕，皮膚表面裂隙較少。ElISA檢測皮膚組織中Th17、IL-6、TNF-α和PGE2的含量，測定結(jié)果表明:與模型組比，治療組

7、皮膚組織中Th17、IL-6、TNF-α和PGE2表達量明顯降低(P＜0.05);與對照組相比，治療組的Th17、TNF-α和PGE2含量沒有顯著性差異(P＞0.05)，但IL-6略高于對照組(P＜0.05)。Western-blot實驗結(jié)果表明，空白組的皮膚中MMP-1、MMP-3蛋白含量較低。模型組皮膚中MMP-1、MMP-3蛋白含量顯著增高，治療組和對照組MMP-1、MMP-3蛋白含量顯著低于模型組，且兩組并無顯著性差異。

8、　　2、體外實驗結(jié)果:
　　復方甘草酸苷促進HaCaT細胞增殖的研究:
　　形態(tài)結(jié)構(gòu)研究:可見藥物干預72h后各組細胞均呈現(xiàn)為正常的細胞狀態(tài)，細胞形態(tài)主要為圓形、橢圓形及多角形，細胞核主要以圓形為主，并可見不規(guī)則的分葉狀，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，其中中、高劑量組均可見較多的細胞核分裂現(xiàn)象，其胞質(zhì)中富含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。細胞周期分布:研究發(fā)現(xiàn)，中、高劑量組的G0/G1期與對照組相比顯著降低(P＜0.01)，而其G2/M期則明顯高于對照組

9、和低劑量組(P＜0.05)。
　　HaCaT細胞CyclinD1、 CDK4及p21蛋白的表達:干預72h后，中、高劑量組的CyclinD1，CDK4蛋白的表達明顯高于其他兩組低劑量組及模型組的表達量(P＜0.05);同時低劑量組及對照組的P21的蛋白表達也要明顯高于中、高劑量組(P＜0.05)。
　　復方甘草酸苷抑制HaCaT細胞凋亡的研究:
　　HaCaT細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察:與對照組相比，通過造模之后的模型組出現(xiàn)了大

10、量的細胞壞死產(chǎn)生，HaCaT細胞出現(xiàn)了嚴重的凋亡現(xiàn)象，而高劑量及中劑量組通過治療藥物干預之后凋亡及壞死都較少發(fā)生。
　　HaCaT細胞Bax、Bcl-2、NF-κB蛋白的表達:誘導凋亡后的HaCaT細胞經(jīng)藥物干預后，其HaCaT細胞的Bax蛋白表達，中劑量組、高劑量組明顯低于模型組，高劑量組明顯低于低劑量組;通過研究發(fā)現(xiàn)HaCaT細胞表達Bcl-2，且有劑量的依賴性，高劑量和中劑量要高于低劑量和對照組，且NF-κB表達也有同樣的特

11、點，高劑量和中劑量要低于低劑量和對照組。
　　Western blot檢測Caspase-3、Caspase-9蛋白表達:中劑量組、高劑量顯著低于模型組，高劑量組和中劑量組要低于低劑量組和對照組。蛋白活性同時顯示，凋亡蛋白的高劑量組和中劑量組要低于低劑量組和對照組。中劑量組、高劑量明顯低于低劑量組。
　　Th17、IL-6、TNF-α和PGE2的含量測定結(jié)果:與模型組比，高、中、低劑量組的Th17、IL-6、TNF-α和PG

12、E2表達量明顯降低(P＜0.05)，且隨著劑量的升高，Th17、IL-6、TNF-α和PGE2表達量明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1、復方甘草酸苷能夠延緩銀屑病模型中皮膚組織的退變，抑制皮膚組織中相關(guān)炎癥因子Th17、IL-6、TNF-α和PGE2的表達，并可抑制MMPs的表達，其抑制作用存在一定的量效關(guān)系，抑制Th17及相關(guān)細胞因子的表達可能是復方甘草酸苷的治療機制。
　　2、復方甘草酸苷在體外能夠促進HaCaT細