HBV X蛋白與細胞色素C氧化酶3相互作用位點的研究.pdf

1、目的：通過酵母雙雜合體系研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)與細胞色素C氧化酶3(COXIII)相互作用的位點。 方法：用常規(guī)PCR和分子克隆技術構建HBV X變異體2種(X1編碼HBV X蛋白1-72氨基酸，X2編碼HBV X蛋白1-117氨基酸)到穿梭質粒pAS2-1(含GAL4-BD)上，通過醋酸鋰方法轉化入酵母AH109，以pAS2-1/X全長為對照；通過Western Blot的方法驗證HBV X全長及變異體-BD融合蛋白

2、在酵母細胞中的表達；經過濾膜轉印法檢測它們的自激活作用，將pAS2-1/X全長及變異體與pACT2/COXIII(pACT2含GAL4-AD)分別轉化入酵母AH109及Y187中，進行酵母雙雜交，在SC/-trp-leu檢測轉化效率，通過藍白斑篩選檢測β-半乳糖苷酶的活性從而得出HBx與COXIII的大致作用位點。 結果：pAS2-1/X變異體通過雙酶切，PCR均檢測出相應的片段，測序結果也符合預期。提取已轉化入變異體的酵母AH

3、109的DNA及蛋白，PCR和Western Blot驗證pAS2-1/X全長及變異體-BD融合蛋白在酵母AH109中的成功表達。濾膜轉印法排除了它們的自激活作用。經過與已轉化有pACT2/COXIII的酵母Y187雙雜交后，在SC/-trp-leu平板上有菌落生成，通過藍白斑篩選，pAS2-1/X1及pAS2-1/X2均未使菌落變藍。 結論：成功構建pAS2-1/X變異體，并在酵母中成功表達。pAS2-1/X變異體1和2均無自