細胞自噬在退變椎間盤中的表達和作用及其相關機制研究.pdf

1、第一部分體外培養(yǎng)中饑餓大鼠髓核細胞的自噬表達及其相關作用
　　 目的:本實驗通過體外培養(yǎng)SD大鼠的髓核細胞，探討細胞自噬在體外培養(yǎng)的髓核細胞中的表達情況及其對髓核細胞的作用。
　　 方法:取30只SD大鼠，顯微鏡下分離髓核組織，使用酶消化法培養(yǎng)原代的髓核細胞，并使用阿利辛和甲苯胺藍染色以及Ⅱ型膠原免疫細胞化學檢測髓核細胞中的蛋白多糖和Ⅱ型膠原來驗證髓核細胞的類軟骨性。取2-3代的髓核細胞，對細胞進行不同的處理后，細胞的自

2、噬泡表達水平使用單丹璜酰戊二胺(MDC)染色和透射電鏡(TEM)進行觀察，細胞自噬標記物LC3和Beclin-1的表達則用Western-blot觀察。細胞的凋亡率和生長抑制率則分別用TUNEL(terminal deoxyribonucleotidyltransferase(TDT)-mediated dUTP-digoxigenin nick end labeling)和CCK8進行檢測。具體分組如下:A組:對照(control)組

3、，B組:3甲基腺嘌呤+DMEM培養(yǎng)基(3-methyladenine3-MA+Dulbecco's Modified Eagle Medium)組，C組:3MA+Earle's balanced salt solution(EBSS)培養(yǎng)基組，D組: EBSS單純的饑餓組。
　　 結果:大鼠髓核細胞呈現梭形和多角形，阿利辛和甲苯胺藍染色分別呈現淡藍色和藍色，Ⅱ型膠原免疫細胞化學則呈現為棕色。電鏡和熒光顯微鏡下觀察到EBSS饑餓誘

4、導下髓核細胞內出現大量的雙層膜的自噬囊泡，但是3-MA抑制后細胞自噬泡明顯減少。C組在電鏡下可觀察到典型的核固縮凋亡細胞結構。自噬標記物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1/β-Actin的表達用Western-blot檢測發(fā)現在單純饑餓組明顯大于3-MA+EBSS處理組和對照組，但是3-MA+EBSS處理組的細胞抑制率和凋亡率明顯高于EBSS處理組。
　　 結論:在體外，細胞自噬存在于饑餓誘導下的大鼠髓核細胞中，并且細胞自

5、噬對饑餓的髓核細胞具有一定的保護作用。
　　 第二部分兔體內退變椎間盤中髓核細胞自噬的表達及其作用
　　 目的:本實驗使用針刺法造成日本大耳白兔腰椎間盤的退變，探討兔椎間盤發(fā)生退變時體內髓核細胞中自噬的表達變化及其對椎間盤的作用方法:取50只日本大耳白兔，每組10只，從前外側入路在L3/4和L5/6的椎間盤外側用16G大小的針頭刺入5mm，并且設立假手術組為對照組。在手術前以及針刺后的2周，4周，8周及12周后麻醉下拍攝

6、腰椎側位X片及腰椎MRI，處死兔子后取相應的椎間盤使用HE染色觀察椎間盤退變情況，并在不同時段取髓核組織后行Western-blot觀察LC3，Beclin-1和P62的表達量，使用透射電鏡(TEM)觀察髓核細胞的自噬泡和凋亡情況，并使用TUNEL檢測髓核細胞的凋亡水平。
　　 結果:針刺后2周，4周，8周及12周，從X片上可見椎間隙逐漸狹窄，T2加權MRI像可見髓核高信號影逐漸減弱，組織學上可以觀察到髓核逐漸纖維化，纖維環(huán)出現

7、裂隙。將正常組，術后4周和12周的椎間盤進行組織學和影像學分級，發(fā)現椎間盤高度指數(disc height index DHI)，組織學分級和Thompson分級指數在退變椎間盤中較正常椎間盤均有明顯的改變(P＜0.05)。TEM在8周和12周從髓核細胞中可以明顯觀察到雙層膜結構的自噬泡，并且能觀察到髓核細胞的軟骨凋亡。髓核細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1的表達量隨著造模時間的延長逐漸增大，P62則逐漸下降。TUNEL顯示