A族鏈球菌上調A20表達以抑制巨噬細胞功能的機制研究.pdf

1、目的:A族鏈球菌(Group A streptococcus，GAS)即化膿性鏈球菌，一類重要的G+致病菌，它可以引起多種不同的化膿性疾病和非化膿性感染后遺癥的產生。巨噬細胞是固有免疫中的主要效應細胞，通過其模式識別受體(PRR)與細菌表面的病原相關分子模式(PAMPs)結合產生效應。其中模式識別受體TLR活化后可以與接頭蛋白MyD88作用，進一步激活TRAF6來調節(jié)NF-KB和MAPKs信號通路。NF-κB激活后轉位入核，通過誘導轉錄

2、因子、急性期蛋白和細胞因子等多種物質的表達來調控免疫反應以適應細胞生存。鋅指蛋白A20是一種免疫負調節(jié)因子，在多種細胞受到LPS、TNF、CD40等刺激后可大量表達，以發(fā)揮雙重泛素化酶作用。既能介導目的蛋白被蛋白酶體降解，又能抑制泛素化依賴信號的傳導。其泛素化作用的底物包括:TRAF2、TRAF6、IKK、Caspase8、RIP1等。本室前期研究表明:GAS作為G+菌其活化巨噬細胞的炎癥反應較G-菌微弱而遲滯，同時還伴隨負調節(jié)蛋白A2

3、0的高表達。1為了探究這種高表達的負調節(jié)蛋白，是否與其導致的炎癥反應低下相關，本研究中以E.coli作為G-菌的對照，GAS刺激鼠源巨噬細胞RAW267.4后分別檢測細胞因子、NF-κB、TRAF6及A20在不同時間點核酸以及蛋白水平表達的差異。2為進一步證實A20高表達與炎癥反應低下有關，A20SiRNA借助脂質體瞬時轉染RAW264.7細胞，通過形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，

4、RISC)，特異性的降解A20的mRNA，從而導致其轉錄后基因沉默。3用GAS感染A20SiRNA預處理后RAW264.7細胞，檢測細胞因子、NF-κB、TRAF6基因和蛋白水平的變化，對比A20SiRNA預處理組和不同對照組之間的差異，為GAS感染后通過巨噬細胞介導微弱而遲緩的炎癥反應，來逃避宿主固有免疫系統(tǒng)的清除作用提供理論依據。4為了探究GAS感染巨噬細胞后A20的高表達是否與MyD88通路激活相關，用GAS或E.coli刺激My

5、D88-/-C57BL/6鼠和野生C57BL/6鼠BMDM細胞后，應用Western blot檢測NF-κB、TRAF6、A20表達的變化。
　　方法:
　　1.RAW264.7細胞分別接受GAS或E.coli刺激，用Real-time PCR、CBA檢測細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10的動態(tài)表達變化。
　　2.應用Western blot檢測NF-κB、TRAF6、A20在GAS或E.coli分別

6、刺激RAW264.7細胞和野生C57BL/6鼠BMDM細胞后不同時間點的變化情況。
　　3.應用RNA干擾技術，借助脂質體將A20SiRNA瞬時轉染RAW264.7細胞而后GAS感染，行Western blot、BCA、Real-time PCR分別檢測A20特異性的干擾后NF-κB、TRAF6以及細胞因子蛋白和基因水平的變化。
　　4.GAS或E.coli刺激MyD88-/-C57BL/6鼠和野生C57BL/6鼠BMDM細

7、胞后，應用Western blot檢測NF-κB、TRAF6、A20表達的變化。
　　結果:
　　1.Real-time PCR檢測細胞因子mRNA的表達情況:GAS刺激組IL-1β、IL-6、TNF-α的表達在7小時以內低于E.coli刺激組，而IL-10的量卻高于E.coli組。其中炎癥因子:IL-1β、TNF-α分別都在3-5小時達高峰;而IL-6、IL-10的量分別在7小時左右達高峰。
　　2.CBA檢測培養(yǎng)上

8、清中細胞因子的表達:GAS刺激組在各個時間點細胞因子的表達量都比E.coli刺激組低，這與Real-time PCR的檢測結果基本一致。
　　3.Western blot檢測GAS或E.coli分別刺激RAW264.7細胞后NF-κB、TRAF6、A20的變化:GAS刺激后，A20從2小時開始表達明顯升高，6、8小時達高峰;E.coli刺激后，A20從4小時開始表達，6、8小時達高峰。并且GAS刺激A20的表達明顯高于E.coli

9、刺激組，而A20所調控的下游分子TRAF6，以及核轉錄因子P65的表達則相應降低，在GAS刺激組低于E.coli刺激組。用C57BL/6鼠的BMDM細胞重復上述實驗，結果一致且更為明顯。
　　4.A20SiRNA瞬時轉染RAW264.7細胞，隨后，以等量GAS刺激該細胞以檢測:
　　A20、TRAF6及P65的表達，結果顯示，A20SiRNA瞬時轉入RAW264.7細胞后，無論基因水平還是蛋白水平檢測不到A20的表達。該細胞

10、受GAS刺激后，P65、TRAF6表達顯著升高，且炎癥反應劇烈，細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-10表達明顯升高。
　　5.Western blot檢測MyD88-/-C57鼠和野生C57BL/6鼠BMDM細胞受GAS和E.coli刺激后A20的表達，結果顯示:盡管MyD88-/-C57鼠BMDM細胞受到刺激，A20幾乎不表達，遠遠低于野生C57BL/6鼠BMDM細胞受到刺激后的高表達。
　　結論: