UCH-L1在乳腺癌中的表達及其與乳腺癌轉移關系的研究.pdf

1、泛素羧基末端水解酶L1（UCH-L1），又叫蛋白基因產物9.5（PGP9.5），屬于泛素羧基末端水解酶家族，參與泛素介導的蛋白質降解途徑，其主要作用是當泛素化的底物附著到蛋白酶體后，UCH-L1水解泛素和底物蛋白質間的鏈，然后底物進入蛋白酶體被降解，而多聚泛素被切割為單體重新參與泛素蛋白酶體的循環(huán)，具有泛素連接酶活性及泛素水解酶活性。早期關于UCH-L1的研究集中于它對神經組織以及性別發(fā)育的作用，尤其在帕金森病的研究中較多。近年研究表明

2、，UCH-L1的表達有嚴格的時間和空間特異性，異常表達常常與細胞的惡性轉化和腫瘤的發(fā)生有關。UCH-L1在多種腫瘤中高表達，在部分腫瘤中其表達與腫瘤浸潤深度、分化程度及淋巴結轉移有關。
　　 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是細胞內的主要信息傳遞系統(tǒng)。p38是MAPK家族重要成員之一。它是一種廣泛存在于細胞質中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可將細胞外信息傳遞至細胞核中，

3、從而介導細胞產生各種反應。p38通過磷酸化轉錄因子引起多種相關基因轉錄，調控活性物質的表達。p38MAPK信號通路參與腫瘤的侵襲和轉移以及腫瘤細胞生長和增殖。
　　 經研究發(fā)現(xiàn)，UCH-L1與p38存在一定關系。非小細胞肺癌中用RNA干擾抑制UCH-L1的表達，能夠抑制非小細胞肺癌體內外的轉移，抑制p38的激活。在乳腺癌中UCH-L1的表達是否與腫瘤的分化程度以及侵襲轉移有關，UCH-L1與p38之間調控關系如何，目前報道較少。

4、
　　 材料和方法：
　　 一、材料
　　 （一）臨床資料
　　 收集80例乳腺癌組織，取自于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院2002年1月至2008年5月手術切除標本。所有患者術前未經任何治療。80例乳腺癌組織均為乳腺浸潤性導管癌（IDC），按TNM分期標準，Ⅰ-Ⅱ期48例，Ⅲ-Ⅳ期32例。有淋巴結轉移33例，無淋巴結轉移47例。收集50例外科手術切除新鮮乳腺組織標本，標本取出后立即置-70℃冰凍保存。其中30

5、例為IDC，（有淋巴結轉移14例），20例為乳腺纖維腺瘤。
　　 （二）細胞系
　　 一種乳腺正常上皮細胞系MCF-10A和兩種乳腺癌細胞系（MCF-7為低侵襲低轉移癌細胞系、MDA-MB-435s為高侵襲高轉移癌細胞系）原購自北京協(xié)和基礎醫(yī)學院細胞中心，本實驗由已有的細胞復蘇而得。
　　 （三）主要試劑
　　 鼠抗人UCH-L1單克隆抗體（sc-58593）購自SANTA CRUZ公司，鼠抗人p-p38

6、單克隆抗體（＃9216）購自Cell signaling公司。UCH-L1抑制劑（＃662086）購自Merck公司。Transwell小室（孔徑8um）購自Coming公司。
　　 二、方法
　　 （一）免疫組織化學技術
　　 80例標本經10％中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法（Streptavidin-peroxidase，S-P）按說明書行免疫組化染色。

7、UCH-L1稀釋比例為1:150，p-p38稀釋比例為1:200，以PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性乳腺癌切片作陽性對照。
　　 （二）Western blot技術
　　 總蛋白從組織、生長到對數(shù)期收集的細胞及不同濃度的UCH-L1抑制劑處理24小時后的MDA-MB-435s細胞中提取。用Bradford法測定蛋白濃度。取等量蛋白，進行SDS-PAGE和轉印，分別孵育一抗（UCH-L11:400，p-p381:400

8、稀釋）4℃過夜，相應二抗（1:4000）37℃孵育，ECL 發(fā)光，拍照。用表達陽性的PVDF膜剝脫后重新孵育β-actin抗體作為內參。
　　 （三）Transwell實驗
　　 上室加入1:6Matrigel膠制成的人工基底膜后接種總體積200ul的MDA-MB-435s細胞，并加入終濃度分別為0u mol、5u mol、10u mol、20u mol的UCH-L1抑制劑。每個藥物濃度做3復孔，37℃培養(yǎng)24h后觀察。

9、擦掉基底膜上室面的細胞，下室細胞固定后Giemsa染色。400×光鏡下隨機選擇30個視野計數(shù)，取其平均數(shù)為穿膜細胞數(shù)。
　　 三、統(tǒng)計學分析
　　 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件行數(shù)據(jù)處理：采用x2檢驗（不滿條件時用Fisher確切概率法）分析各組計數(shù)資料，采用Spearman等級相關分析UCH-L1蛋白與p-p38蛋白表達的關系，采用t檢驗分析Western Blot圖像灰度值，transwell穿膜細胞數(shù)，用LSD-t

10、檢驗對各樣本均數(shù)行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 一、UCH-L1、p-p38在乳腺癌組織中的表達及其同臨床病理參數(shù)的關系
　　 在80例IDC石蠟標本中，UCH-L1陽性表達42例（52.5％），定位于細胞漿。p-p38陽性表達46例（57.5％），主要定位于細胞核，少量定位于細胞漿。統(tǒng)計學分析顯示，UCH-L1蛋白表達和p-p38蛋白表達呈正相關（r=0.397，P=0.000

11、）。兩者表達水平均與IDC的TNM分期（P=0.017，P=0.010）、淋巴結轉移情況（P=0.033，P=0.021）相關，UCH-L1的表達與組織學分級相關（P=0.032），而p-p38的表達與組織學分級無關（P=0.794），二者與患者年齡（P=0.296，P=0.585），腫瘤大?。≒=0.300，P=0.161）無明顯相關性。
　　 在新鮮乳腺組織中，UCH-L1、p-p38在IDC中的表達高于乳腺纖維腺瘤組（P=

12、0.012，P=0.001），兩者的表達水平在Ⅲ-Ⅳ期IDC中高于Ⅰ-Ⅱ期（P=0.014，P=0.002）；在有淋巴結轉移的乳腺癌中高于無淋巴結轉移患者（P=0.016，P=0.001）；UCH-L1的表達與組織學分級有關（P=0.038），而p-p38的表達與組織學分級無關（P=0.130），二者的表達均與患者的年齡、腫瘤大小無明顯相關性（P=0.753，P=0.539；P=0.723，P=0.765）。
　　 二、UCH-

13、L1、p-p38在乳腺細胞系中的表達
　　 Western blot檢測，乳腺上皮細胞系MCF-10A和乳腺癌細胞系MCF-7，MDA-MB-435s中兩種蛋白表達水平呈遞增趨勢。
　　 三、UCH-L1抑制劑作用MDA-MB-435s細胞系24h后觀察各指標改變
　　 UCH-L1抑制劑可以濃度依賴性地下調MDA-MB-435s細胞系中p-p38蛋白表達水平，并能抑制乳腺癌細胞的侵襲轉移潛能（P均<0.05）。