肌源性干細胞的表型研究及體外誘導分化為平滑肌細胞的實驗研究.pdf

1、本實驗從新西蘭兔肌肉中分離出MDSC加以鑒定，并將其誘導為平滑肌細胞，研究其表形特征及探索其分化特性。 研究材料與方法： 1.實驗動物：新西蘭大白兔，雌雄不限，體重約1.5～2.0Kg，月齡1～1.5個月。 2.實驗試劑與器材：小鼠抗α平滑肌肌動蛋白抗體(α-SMactin，α-SMA)、小鼠抗desmin、小鼠抗skeletalmyosin(fast)、小鼠抗vimentin、FITC-羊抗小鼠IgG、Cy3-

2、羊抗小鼠IgG、ⅩⅠ型膠原酶；馬血清(HS)、DMEM-LG、Trypsin；dispase；胎牛血清；兔抗GAPDH；BCA-100蛋白定量測定試劑盒；二抗曝光試劑盒。流式細胞儀、超凈臺、顯微外科器械等。 3.MDSC的分離、培養(yǎng)、鑒定及其融合特性檢測：利用Preplate技術(shù)分離MDSC：無菌條件下取得新西蘭兔的臀肌并剪成肉泥，依次使用Ⅺ型膠原酶、dispase及胰酶對組織進行消化，得到的細胞懸液接種入培養(yǎng)瓶，此為PP1；細

3、胞培養(yǎng)箱中孵育2小時后將PP1中的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)膠原包被的培養(yǎng)瓶，此為PP2；隨后每24小時將懸液轉(zhuǎn)移至膠原包被的培養(yǎng)瓶，此為PP3～PP6。PP6中相當大部分即為MDSC。收集PP6細胞，利用流式細胞儀(FCM)檢測其desmin、CD45及Bcl-2陽性細胞的百分數(shù)；利用免疫細胞化學檢測desmin表達；利用WesternBlotting檢測PP1～PP6中α-SMA的表達趨勢。在高匯合度或低血清濃度培養(yǎng)基的條件下檢測MDSC的融合傾

4、向。 4.MDSC體外誘導分化為平滑肌細胞的實驗研究：誘導分化采用共培養(yǎng)誘導體系和直接誘導體系。 (1)共培養(yǎng)誘導：細胞用Hoechst33342進行細胞核的標記，接種至六孔板，每孔內(nèi)加入等量的兔海綿體平滑肌細胞(CSMC)進行共培養(yǎng)，2天后進行免疫細胞化學檢測α-SMA表達情況。同時設置未處理組以及陽性對照組。 (2)直接誘導：細胞接種到六孔板后添加含25ng/ml血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，2天

5、后進行免疫細胞化學以及WB法檢測α-SMA表達情況。同時另設一未處理組，陰性對照組以及陽性對照組。 實驗結(jié)果：Preplate技術(shù)分離的細胞中PP1和PP2貼壁細胞相對較少，PP3開始即有大量的短梭形、圓形或多角形細胞貼壁，這些小體積細胞數(shù)量到PP6時增至80％。它們極易融合，生長呈方向性。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示PP6細胞的desmin、CD45以及Bcl-2的陽性率平均為83.10±0.16％、0.79±0.03％及79.90

6、±0.20％。免疫細胞化學檢測可見較多的desmin陽性細胞。WesternBlotting顯示PP6不表達α-SMA。融合實驗發(fā)現(xiàn)PP6細胞在高匯合度或低濃度血清的條件下培養(yǎng)時會很快融合成細胞鏈，而低匯合度或高血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞則不會出現(xiàn)這種情況。 共培養(yǎng)誘導組及直接誘導組在處理2天后，利用免疫細胞化學以及WesternBlotting等檢測均見平滑肌細胞特異型抗原α-SMA的表達。 研究結(jié)論：利用Preplate技