靶向特異性基因的小干擾RNA抑制膠質瘤生長的研究.pdf

1、[目的]研究靶向胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的小干擾RNA(siRNA)對膠質瘤生長的抑制作用；構建靶向血管內皮生長因子(VEGF)、神經生長因子(NGF)雙基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)真核表達載體并鑒定，用于膠質瘤基因治療。 [方法]第一、二部分：體外化學合成靶向IGF-1R和IGF-1基因的siRNA，脂質體法將siRNA以不同濃度梯度轉染膠質瘤C6細胞，同時使用綠色熒光素

2、標記的小干擾RNAFITC-siRNA轉染細胞，熒光顯微鏡下觀察siRNA轉染效率；RT-PCR和Westernblot測定RNA干擾后IGF-1R和IGF-1的表達水平：采用Transwell體外侵襲試驗進行細胞體外的侵襲力分析；流式細胞儀檢測細胞凋亡率和周期；裸鼠成瘤實驗測定IGF-1R和IGF-1基因表達下調后膠質瘤C6細胞在裸鼠體內致瘤能力的改變。 第三部分：分別設計并體外合成靶向基因VEGF、NGF的特異性編碼shRN

3、A序列的寡核苷酸，克隆到經BglⅡ—HindⅢ酶切線性化的pSUPER質粒H1啟動子下游，構建shRNA重組質粒，進而脂質體介導瞬時轉染膠質瘤細胞系U251，半定量RT-PCR檢測VEGFmRNA、NGFmRNA表達。 [結果]第一部分：熒光顯微鏡下熒光素標記的siRNA轉染組可見到細胞質內清晰的綠色熒光，脂質體OligofectamineTM2000的轉染效率接近100％：靶向IGF-1R基因的siRNA可以有效抑制IGF-1

4、R基因的表達，各特異性siRNA不同濃度轉染組IGF-1RmRNA表達水平可下調約10％-80％，蛋白表達減少50％；流式細胞術檢測細胞凋亡率轉染組為22．47％±3．15％，與陰性對照組2．3％±0．9％和空白對照組1．14％±0．79％比較有明顯提高，而陰性、空白對照組相比無明顯差異；腫瘤細胞的侵襲力明顯下降，在裸鼠體內成瘤的能力大大降低。 第二部分：靶向IGF-1基因的siRNA可以有效抑制IGF-1基因的表達。熒光顯微鏡

5、下熒光素標記的siRNA轉染組可見到細胞內清晰的綠色熒光，脂質體OligofectamineTM2000的轉染效率可達95％以上：各特異性siRNA不同濃度轉染組IGF-1mRNA表達水平可下調約40％-70％，蛋白表達減少60％，流式細胞術檢測轉染IGF1-siRNA細胞凋亡率為15．07％，與對照組(1．98％)比較有明顯提高，腫瘤細胞的侵襲力明顯下降(P＜0．01)，降低了在裸鼠體內成瘤的能力(P＜0．01)。 第三部分：