青光眼濾過手術對眼免疫赦免的影響及其機制的實驗研究.pdf

1、青光眼是位列世界第一位的不可逆性致盲眼病。我國非選擇性人群的原發(fā)性青光眼患病率為0.52％，致盲率為10％。青光眼治療的主要目的是降低眼壓，包括藥物治療、激光治療、手術治療，其中青光眼濾過手術仍是目前青光眼治療的主要手段之一，手術主要通過建立一條新的眼外引流途徑，將房水自前房直接或間接(通過房水引流裝置)引流至球結膜下間隙(形成濾過泡)，然后經(jīng)球結膜滲漏到淚膜或由周圍組織吸收，從而達到降低眼壓以保全視功能的目的。功能濾過泡的維持是青光眼

2、濾過手術成功的標志之一，但濾過手術由于破壞了眼球壁生理結構的完整性，且非生理性濾過泡隆起于眼表，故眼局部組織的結構和功能受到一定的影響。 眼組織結構的完整性對于維持正常視功能具有重要意義，此種組織結構完整性有賴于多種機制，其中最重要的機制之一是眼內(nèi)免疫赦免機制，而前房相關性免疫偏離(anterior chamber-associated immune deviation，ACAID)是形成和維持眼免疫赦免狀態(tài)的核心機制。所謂AC

3、AID是指前房引入抗原(人工引入或眼內(nèi)抗原進入)后所誘發(fā)的一種全身性免疫偏離現(xiàn)象，特征性地表現(xiàn)為遲發(fā)型超敏反應(delayed-type hypersensitivity，DTH)缺如及誘導出特異性非補體結合抗體和細胞毒性T淋巴細胞的前體細胞，是機體防御眼部特異性和非特異性炎癥的一種重要機制。誘導ACAID的機制目前尚不完全清楚，但眼部的局部解剖學因素是其形成的重要因素：由于眼內(nèi)腔缺乏淋巴管引流，大部分的房水進入眼前節(jié)的靜脈系統(tǒng)而引流吸

4、收，使前房內(nèi)抗原繞過局部淋巴結而直接進入脾臟，脾臟取代局部淋巴結直接接受并處理抗原信息，從而誘導產(chǎn)生ACAID特征性的抗原特異性調(diào)節(jié)性T細胞亞群。目前研究表明，抗原通過小梁網(wǎng)進入靜脈途徑并直接到達脾臟對于ACAID的誘導起著關鍵性作用。 與其他類型的器官移植相比，正位角膜移植成功率較高，目前認為主要原因是移植后多數(shù)患者出現(xiàn)了ACAID；而針對高危移植受體，如果預先誘導針對移植抗原的ACAID則可延長移植物的存活時間。嚴重角膜病變

5、合并青光眼是一組十分難于治療的病例，一般需要進行穿透性角膜移植術，同時及時地控制眼壓。近年來多項臨床研究顯示，青光眼引流管植入術后行角膜移植的患者中，角膜植片的排斥率顯著增高。多項對角膜移植聯(lián)合青光眼引流管植入術的術后的遠期效果觀察均指出：引流管植入有效地控制了眼壓，但是引流管的存在是角膜移植的獨立危險因素，在排除了引流管的機械損傷等因素后，植片的免疫排斥率仍有所增高。 綜上所述，ACAID是機體的重要免疫赦免機制之一，對于正常

6、視功能的維持具有重要意義，是角膜移植成功率較高的主要機制，眼內(nèi)抗原大部分隨房水進入靜脈系統(tǒng)到達脾臟而繞過局部淋巴結對其形成有重要作用。而在青光眼引流管植入患者，角膜移植排斥率顯著增高。因此，本課題正是基于上述免疫學的研究進展，結合臨床研究結果，我們提出以下假說：青光眼濾過手術破壞了眼局部的解剖結構，有可能使前房內(nèi)抗原與局部淋巴結接觸機會增多而破壞了ACAID的誘導，進而影響了眼部的免疫赦免狀態(tài)。本課題首先建立青光眼濾過手術的動物模型；然

7、后，通過前房注射抗原進行DTH的誘導和檢測，研究青光眼濾過手術是否會對ACAID的誘導產(chǎn)生影響；最后，通過前房注射熒光標記抗原，檢測青光眼濾過手術后前房內(nèi)抗原引流途徑的變化，初步揭示其影響機制。 本課題的研究主要分為以下三部分：　　目的：制作大鼠青光眼濾過手術模型，對以往建立的動物模型進行補充，為實驗研究提供可靠的動物模型。 方法：雄性SD大鼠10只，全麻固定后，制作以角膜緣為基底的結膜瓣，通過全鞏膜隧道穿入前房一25

8、號硅膠管，末端埋于結膜下，連續(xù)縫合結膜瓣。術后每天全麻后測雙眼眼壓，顯微鏡下觀察濾過泡形成情況；同樣方法做另外3只大鼠，分別于術后2、5、11 d做組織學檢查，觀察術后濾過泡區(qū)域組織學變化。 結果：通過大鼠前房引流管植入術，可以在結膜下形成良好的濾過泡，術眼眼壓明顯下降，組織學檢查可見明確的結膜下疏松區(qū)域，未見前房出血或引流管堵塞等并發(fā)癥，濾過泡經(jīng)過7-11 d逐漸瘢痕化。 結論：大鼠前房微管植入術是一個可靠的青光眼濾過

9、手術動物模型，經(jīng)濟實用，為下一步的研究奠定了很好的動物模型基礎。 目的： ACAID是眼免疫赦免的核心機制，本研究在青光眼濾過手術動物模型檢測ACAID的誘導情況，探討手術破壞眼局部解剖結構對ACAID的影響，以期初步揭示濾過手術對眼免疫赦免的可能影響。 方法： 動物分為以下四組，進行ACAID誘導： 第一組，ACAID陽性誘導組：大鼠全麻固定后，在解剖顯微鏡下將牛血清白蛋白(bovine serum a

10、lbumin，BSA)溶液(5 μl／50μg)注入前房；前房注射后第7 d于大鼠前肢皮下注射BSA(100 μg／200 μl)與等體積弗氏完全佐劑混懸液；7 d后于大鼠右耳廓皮內(nèi)注射BSA100 μg，左耳廓皮內(nèi)注射等量無菌磷酸緩沖液，24 h后檢測DTH反應。 第二組，ACAID陰性對照組：大鼠前房內(nèi)注入無菌磷酸緩沖液，其他操作同上，作為陰性對照。 第三組，濾過手術組：行青光眼濾過手術大鼠，術后2 d觀察無前房出血

11、等并發(fā)癥，方法同(1)進行ACAID誘導。 第四組，假手術組：進行與濾過手術同樣的操作，但不形成功能性外引流，ACAID誘導方法同上。 結果： DTH檢測結果顯示，陽性對照組大鼠右耳廓未出現(xiàn)明顯的紅腫，其耳廓腫脹數(shù)值與陰性對照組差異明顯(P<0.001)，說明ACAID模型誘導成功。濾過手術組大鼠右耳廓可見明顯紅腫，其耳廓腫脹數(shù)值與陽性對照組比較有明顯差異(P<0.001)，即DTH未受抑制，說明青光眼濾過手術影響了AC

12、AID的誘導。而假手術組動物右耳廓未見明顯紅腫，與陽性對照組無明顯差異(P>0.05)。 結論：行青光眼濾過手術大鼠不能正常誘導ACAID，說明濾過手術后眼免疫赦免狀態(tài)發(fā)生了改變。而假手術組動物誘導ACAID能力是正常的，說明除了手術創(chuàng)傷等因素以外，前房與結膜下間隙的溝通是影響ACAID誘導的主要因素。 目的：擬通過研究青光眼濾過手術后前房內(nèi)抗原的引流及分布的改變，探討局部淋巴結及脾臟在其中的作用，初步揭示青光眼濾過手術

13、影響免疫赦免的機制。 方法： (1)制作頸部淋巴結切除動物模型，檢測青光眼濾過手術后ACAID誘導的情況。 (2)前房注射熒光標記抗原(FITC—Dextran)，在前房注射后第1、3、5、7及12 d進行青光眼濾過手術動物與正常動物脾臟及頸部淋巴結取材，制作冰凍切片，對熒光標記抗原在不同組織中的分布進行定性觀察，比較濾過手術動物與正常動物間的不同。 (3)利用流式細胞技術，檢測不同時間點脾臟、淋巴結中F

14、ITC+細胞百分數(shù)的變化和不同，對前房抗原在不同組織的分布進行定量檢測，比較濾過手術動物與正常動物組間的不同。 結果： (1)在頸部淋巴結切除動物，青光眼濾過手術后抗原特異性的DTH受到抑制，ACAID誘導能力恢復正常。 (2)前房注射抗原后，可觀察到熒光抗原在脾臟及淋巴結的分布，脾臟中熒光抗原主要位于脾小結的周圍，而頸部淋巴結主要位于被膜下髓竇。各時間點在脾臟和淋巴結的分布方式未見明顯不同；濾過手術動物與正常動

15、物間未見明顯不同。 (3)濾過手術大鼠，在前房注射后第1 d頸部淋巴結FITC陽性細胞百分數(shù)(-x±SD：2.96±0.67％)明顯高于正常大鼠(1.57±0.4.8％)(P=0.001.)，而其它時間點兩組間差異不明顯。在青光眼濾過手術動物，前房注射后第5d(4.3±0.40)及第7d(2.01±0.25)脾臟FITC陽性細胞百分數(shù)明顯低于正常動物(8.47±0.15，4.23±0.02)(P<0.001)。 結論：頸

16、部淋巴結在青光眼濾過手術影響眼免疫赦免中起重要的作用。對前房內(nèi)熒光標記抗原在淋巴器官的定量研究發(fā)現(xiàn)，濾過手術動物頸部淋巴結熒光陽性細胞百分數(shù)較正常動物顯著增高，在ACAID誘導的關鍵時期，脾臟陽性細胞百分數(shù)較正常明顯降低，提示可能這兩方面都有參與其影響機制。 小結： 本課題研究發(fā)現(xiàn)，青光眼濾過手術影響了ACAID的正常誘導，而在假手術動物中，ACAID的誘導能力是正常的，說明前房與結膜下間隙的溝通是影響ACAID誘導的主

17、要因素。通過頸淋巴結切除動物模型中濾過手術后ACAID的檢測，發(fā)現(xiàn)其誘導能力又恢復正常，說明頸部淋巴結在其影響過程中起重要作用。為了進一步探討其影響機制，我們通過前房注射熒光標記抗原，檢測濾過手術后前房內(nèi)抗原引流途徑的變化。研究發(fā)現(xiàn)，前房內(nèi)抗原在注射后不同時間點分布于脾臟及頸部淋巴結，定性觀察濾過手術大鼠與正常大鼠間差別不大，而進一步通過流式細胞儀定量觀察發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠，前房注射后第5 d到達脾臟的抗原數(shù)量有明顯的上升趨勢，而頸部淋巴