自噬基因Beclin 1與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性研究.pdf

1、骨肉瘤是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤,轉(zhuǎn)移發(fā)生早,預(yù)后差。目前臨床上對骨肉瘤的治療多采用手術(shù)、化療等綜合治療,雖然五年生存率較前有明顯提高,但療效仍不滿意。大劑量化療帶來的嚴(yán)重副反應(yīng)以及多藥耐藥等問題使得骨肉瘤的治療難以完全治愈?；蛑委熆赡艹蔀槟切┮褑适中g(shù)時機患者的新的治療手段。研究表明,腫瘤細胞惡性增殖,死亡的減少與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的密切相關(guān)。并且使細胞耐受放療、化療的刺激。因而,誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡成為了一種新的殺傷腫瘤細胞的治療策略

2、。 自噬性細胞死亡是一種不同于凋亡、不依賴caspase的程序性細胞死亡。有研究表明自噬的抑制與腫瘤的發(fā)生有關(guān),沉默自噬基因Beclinl可導(dǎo)致多種惡性腫瘤的發(fā)生,是一個候選的腫瘤抑制基因。因此,我們認(rèn)為,骨肉瘤的Beclinl表達狀況的研究是極具研究價值的課題。Beclinl基因可能成為骨肉瘤基因治療更具針對性的目的基因,研究自噬基因Beclinl在骨肉瘤細胞中的表達狀況以揭示其在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的意義,對于揭示骨肉瘤的發(fā)病機

3、理,并尋找針對這一頑疾的新的治療策略,具有十分重大的意義。為此我們進行了以下三部分實驗研究。 第一部分 Beclinl基因在人成骨肉瘤細胞株MG63和人成骨細胞株hF0B1.19中mRNA及蛋白表達的差異性 目的:明確人成骨肉瘤細胞MG63以及人成骨細胞hF0B1.19中自噬基因Beclinl的表達差異情況,探討其與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。 方法:采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及免疫印記法(Wester

4、n blot),對人成骨肉瘤細胞MG63及成骨細胞hF0B1.19中Beclinl mRNA及蛋白的表達水平進行檢測。 結(jié)果:人成骨肉瘤細胞MG63中Beclinl mRNA及蛋白表達水平明顯降低,其表達水平顯著低于對照組人成骨細胞hF081.19。 結(jié)論:自噬基因Beclinl在骨肉瘤細胞中表達異常與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。 第二部分 Beclinl基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及鑒定 目的:構(gòu)建攜帶自噬

5、基因BeclinlcDNA的真核表達質(zhì)粒,瞬時轉(zhuǎn)染并在人成骨肉瘤細胞MG63中表達,為骨肉瘤的基因治療奠定基礎(chǔ)。 方法:應(yīng)用基因重組技術(shù)和限制性內(nèi)切酶,酶切構(gòu)建并鑒定pEGFP/Beclinl真核表達質(zhì)粒,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的骨肉瘤細胞株MG63細胞,熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及免疫印記法(Western blot)來檢驗?zāi)康幕蚣捌涞鞍妆磉_情況。 結(jié)果:重組真核表達質(zhì)粒pEDFP/Becli

6、nl中插入序列由大連寶生物公司測序核實,證明重組質(zhì)粒連接正確,經(jīng)定量RT-PCR檢測表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人成骨肉瘤細胞株MG63后,Beclinl mRNA在人成骨肉瘤細胞MG63同空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染的人成骨肉瘤細胞MG63的相對拷貝量明顯增加,Western blot檢測轉(zhuǎn)染后人成骨肉瘤細胞MG63中Beclinl蛋白明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染細胞組。 結(jié)論:成功地構(gòu)建了pEGFP/Beclinl真核表達質(zhì)粒,并能在人成骨肉瘤細胞

7、中表達Beclinl mRNA,為骨肉瘤的基因治療提供了必要的條件。 第三部分 外源性人Beclin1基因轉(zhuǎn)染對人成骨肉瘤細胞MG6體外生長的抑制作用 目的：研究外源性人Beclinl基因在人成骨肉瘤細胞MG63中過表達對其體外生長的抑制作用和對甲氨碟呤化療敏感性以及細胞自噬的影響。 方法：應(yīng)用重組質(zhì)粒pEGFP/Beclinl,以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人成骨肉瘤細胞株MG63,以pEGFP及空白轉(zhuǎn)染組為對照

8、,應(yīng)用MTT法分析外源性Beclinl過表達對人成骨肉痛細胞株G63增殖的影響,并用流式細胞儀檢測凋亡率的變化和對MTX的化療療效的影響。應(yīng)用MDC染色觀察轉(zhuǎn)染細胞自噬情況 結(jié)果：pEGFP/Beclinl轉(zhuǎn)染人成骨肉瘤細胞MG63后細胞增殖有明顯減慢,較PEGFP轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組兩者之間差異有顯著性(P<0.05)。pEGFP/Beclinl轉(zhuǎn)染72小時后人成骨肉瘤細胞MG63的凋亡率高于對照組,差異有顯著性(P<0.05)。