銀杏葉提取物與轉基因誘導A20過表達在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、第一章:A20基因表達載體的構建、質粒的提取及體外鑒定
　　目的:1、構建一種攜帶A20基因的表達載體。2、培養(yǎng)大腸桿菌，提取高濃度、高純度的質粒DNA。3、質粒DNA的體外鑒定。
　　方法:1、構建成A20的基因表達載體pcDNA3.1-A20，并將帶有目的基因的質粒轉化到感受態(tài)大腸桿菌中，用空質粒載體pcDNA3.1作為對照，-20℃保存?zhèn)溆谩?、大腸桿菌采用固體LB培養(yǎng)基劃盤，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16h，挑取單菌

2、落，接種于5ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置37℃恒溫搖床，轉速210r/min，培養(yǎng)12～16h，提取質粒DNA，測定其濃度，并對其進行1％瓊脂糖凝膠電泳，以確定是目的基因。3、重組質粒DNA經過體外細胞轉染，熒光倒置顯微鏡觀察細胞轉染的表達情況。
　　結果:1、經過酶切、提取、電泳鑒定后結果完全正確。2、體外轉染HK-2細胞，有綠色熒光表達的細胞為轉染細胞。
　　結論:體外實驗證實A20基因表達載體可有效轉染HK-

3、2細胞。
　　第二章:銀杏葉提取物與轉基因誘導A20過表達在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用
　　目的:1、建立一種穩(wěn)定、可靠的大鼠腎缺血再灌注損傷模型。2、觀察銀杏葉提取物及轉基因方法誘導A20過表達對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的作用，為臨床防治腎IRI提供實驗性理論依據。
　　方法:1、雄性SD大鼠，體重250～280g，用50mg/kg體重戊巴比妥鈉腹腔內注射麻醉，打開腹腔，分離左腎動脈和靜脈，微型血管夾夾閉左腎動靜脈

4、45min，夾閉期間行右腎切除術。45min后松開血管夾，觀察大鼠左側腎臟血管再灌注情況并縫合腹部切口。制成大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型。2、技術熟練后，行大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型制作。實驗大鼠隨機分四組:分別為生理鹽水組、A20組、銀杏葉組、A20+銀杏葉組，每組8只大鼠。術前48小時對生理鹽水組、A20組、A20+銀杏葉組，分別通過尾靜脈注射生理鹽水、脂質體pcDNA3.1-A20+生理鹽水250μl(15μl脂質體加10μg構建的

5、質粒DNA混勻后加入生理鹽水至250μl)，銀杏葉組和A20+銀杏葉組于術前30min腹腔注射銀杏葉提取物50mg/kg。手術后24h收獲大鼠，分別由下腔靜脈采血5ml，取左側腎臟，腎臟組織分三部分，1/3置于10％中性福爾馬林緩沖液中固定，待作組織學檢查，另2/3組織分兩部分，速凍于液氮并轉存于-80℃冰箱保存，行相關檢測。血清采用全自動生化分析儀檢測Scr、BUN，腎組織HE染色行病理學檢測，TUNEL法檢測腎小管上皮細胞的凋亡情況

6、，Westernblot法檢測A20蛋白的表達，RT-PCR檢測A20mRNA水平的表達，EMSA檢測NF-kB的活性。
　　結果:1、經過練習，建立了比較穩(wěn)定的大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型。手術成功率可達95％。2、A20組和A20+銀杏葉組血清Scr、BUN水平明顯低于其余各組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。A20+銀杏葉組與A20組比較，差異有統(tǒng)計學意義;各組腎小管都有不同程度的損傷，銀杏葉組、A20+銀杏葉組以腎小管上皮

7、細胞刷狀緣損傷為主，與生理鹽水組比較，腎組織病理損傷明顯減輕(P均＜0.05)。A20組與生理鹽水組比較，腎小管擴張，腎小管上皮細胞刷狀緣脫落、壞死，蛋白管型等腎臟組織病理損傷減輕，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;腎小管上皮細胞凋亡多見于遠端小管，與生理鹽水組比較，各組凋亡細胞數均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);銀杏葉組和A20+銀杏葉組與A20組比較，凋亡細胞數明顯減少（P均＜0.05）;各組A20蛋白及mRNA水平表達

8、均有所升高，與生理鹽水組比較，A20組與A20+銀杏葉組升高更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）;各組NF-kB的活性均不同程度受抑制，與生理鹽水組比較，A20組與A20+銀杏葉組中，NF-kB活性受抑制更明顯。
　　結論:銀杏葉提取物與轉基因方法均能上調A20基因在體內的表達，改善腎功能，減輕腎IRI的病理損害及腎小管上皮細胞凋亡，從而達到腎臟保護作用，且二者合用效果較為突出，其機制可能與A20抑制腎小管上皮細胞凋亡，通過