補體膜攻擊復(fù)合物對腎小管上皮細胞亞溶破損傷效應(yīng)的研究.pdf

1、研究背景與目的： 腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitialfibrosis，TIF)是腎臟疾病進展至終末期腎衰的共同通道，以細胞外基質(zhì)(extracellurmaitix，ECM)在腎臟間質(zhì)組織中過度積聚為特征。腎小管上皮細胞(humankidneyproximaltubularcells，HKCs)在結(jié)構(gòu)上與腎間質(zhì)緊密相連，是間質(zhì)損傷的核心細胞；HKCs的損傷及損傷后反應(yīng)是引TIF的主要因素之一。 補體系

2、統(tǒng)是體內(nèi)重要的天然免疫防御系統(tǒng)，當病原微生物或炎性介質(zhì)存在時可被激活，最終通過末端成分組裝成C5b-9(n)，即補體膜攻擊復(fù)合物(membrane attack complex，MAC)。非致死劑量的MAC(sublyticMAC，sMAC)可沉積于多種有核細胞，刺激細胞發(fā)生代謝改變，分泌炎性介質(zhì)，并誘導(dǎo)細胞因子、粘附分子及其它功能蛋白的表達，這些效應(yīng)統(tǒng)稱為sMAC的亞溶破刺激效應(yīng)。腎臟是免疫損傷的主要靶器官之一，大多數(shù)腎小球腎炎患者的

3、腎小球及腎小管區(qū)均發(fā)現(xiàn)有sMAC沉積物，并與腎臟的損傷密切相關(guān)，因此研究補體活化后產(chǎn)生的sMAC對腎臟細胞的亞溶破刺激效應(yīng)具有重要意義。目前，sMAC對內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、腎小球細胞等多種有核細胞的亞溶破刺激效應(yīng)已有報道，但對HKCs產(chǎn)生的亞溶破刺激效應(yīng)報道甚少。HKCs與其它腎臟固有細胞比較，其補體調(diào)節(jié)蛋白表達較弱，因此，HKCs更易遭受補體復(fù)合物介導(dǎo)的免疫損傷。 Ⅳ型膠原(CollagenⅣ，ColⅣ)是小管間質(zhì)區(qū)ECM重要

4、組份之一，部分來源于腎小管上皮細胞；已有研究證明某些損傷因素的刺激可導(dǎo)致腎小管上皮細胞ColⅣ表達增加；此外有研究顯示，在有C3及MAC沉積的腎小管問質(zhì)損傷區(qū)，同時亦有ColⅣ堆積，但相關(guān)研究尚不深入；基于以上分析，推測sMAC可能對HKCs產(chǎn)生刺激效應(yīng)并影響HKCs對ColⅣ的表達，參與TIF的發(fā)生機制。 本研究以HKCs為靶細胞，提取人血清補體優(yōu)球蛋白C56，體外組裝sMAC，建立HKCs亞溶破模型；觀察并檢測sMAC對HK

5、Cs的亞溶破效應(yīng)及其對ColⅣ表達的影響，探討sMAC和HKCs在腎問質(zhì)纖維化發(fā)病機制中的意義，為腎間質(zhì)纖維化的臨床防治提供新的思路。 方法： 1.采用酵母多糖激活紅細胞沉降率＞30mm/h的病人血清，提取C56，微量板孔法判定補體C56活性，分離及提純C56；梯度稀釋純化C56，以新鮮正常人血清(NHs)作為C7～C9來源，微量溶血法滴定C56，觀察不同稀釋度對豚鼠紅細胞的溶血活性。 2.體外組裝sMAC，激光

6、共聚焦顯微鏡(Laserconfocalmicroscopy，LSCM)、倒置熒光顯微鏡在形態(tài)上證實MAC在細胞膜上的正確組裝；CCK-8細胞活力實驗檢測MAC對HKCs亞溶破量-效關(guān)系并確立MAC的最適亞溶破劑量。 3.倒置相差顯微鏡觀察sMAC刺激HKCs后不同時相點細胞形態(tài)學(xué)變化。脫落細胞計數(shù)及臺盼蘭拒染法檢測細胞粘附力及細胞活力的改變。流式細胞儀檢測sMAC刺激HKCs后ColⅣ表達的時-效和量-效關(guān)系。 結(jié)果：

7、 1.血沉高于30mm/h的病人血清經(jīng)酵母多糖活化后，用微量板孔法測定補體C56活性，有36孔出現(xiàn)溶血；其溶血活性與C56呈劑量依賴關(guān)系。 2.分離提純的補體優(yōu)球蛋白C56能與正常人血清(NHS)中C7～C9補體終末成分體外正確組裝成MAC，建立亞溶破模型。CCK-8細胞活力實驗確立MAC對HKCs最適亞溶破劑量為C561:480，1:40EDTA-NHS；在該劑量刺激下，激光共聚焦和倒置熒光顯微鏡觀察sMAC在HKCs

8、膜表面大量沉積，同時細胞形態(tài)沒有發(fā)生明顯改變，細胞膜完整性好；流式細胞儀顯示細胞表面也有MAC沉積。提示所加入的MAC是亞溶破劑量的MAC，細胞能夠抵抗MAC的溶細胞作用。 3.sMAC刺激HKCs后鏡下脫落細胞計數(shù)見細胞粘附力下降、脫落明顯，臺盼蘭拒染法見細胞活力未受影響，流式細胞技術(shù)檢測ColⅣ的表達顯著增高，且與sMAC刺激劑量及刺激時間呈正相關(guān)(p＜0.05)。 結(jié)論： 1、采用酵母多糖法成功提取了補體優(yōu)