蛋白質芯片技術對男性不育精漿相關蛋白質群的分析.pdf

1、男性不育是引起不孕癥的重要因素之一。據2000年世界衛(wèi)生組織報道，在全世界約8000萬對不孕不育夫婦中，男方因素約占40％，女方因素約占50％，男女雙方因素約占10％。在我國，根據對河北省10個地區(qū)39476對育齡夫婦抽樣調查，發(fā)現男性不育者占33.15％。導致男子不育的原因非常復雜廣泛，涉及生殖系統(tǒng)解剖結構和功能、激素調節(jié)、遺傳物質、感染免疫等諸多因素的異常和障礙?，F階段對這些因素的研究大多停留在單基因水平和基因組水平。然而，機體真正

2、生理機能的執(zhí)行者是蛋白質，所以上述分子遺傳學研究并不能反映基因轉錄后的調控、蛋白質表達水平的變化以及蛋白質的翻譯后修飾等信息，并且細胞內mRNA水平和蛋白質的表達峰度并不完全一致，因此從蛋白質水平對男性不育機制進行研究顯得特別重要。 目前對蛋白組學研究多是采用經典的雙向電泳技術，通過蛋白質等電點和分子質量的不同而進行分離，這種方法對于分子質量較大、含量較多的蛋白質有很好的分離作用。但不利于小分子質量、微量蛋白質的分離與鑒定。

3、 蛋白質芯片-飛行時間質譜技術(Surface Enhanced Laser Desorption/lonization-Time of Flight Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS)是1993年后才發(fā)展的起來的一項新的蛋白質研究技術，是繼基因芯片之后發(fā)展起來的生物檢驗技術，是蛋白芯片與表面加強激光解吸電離飛行質譜的技術組合。它以其高度并行性、高通量、微型化和自動化的特點而很快成為研究蛋白質組學的有力工

4、具。其優(yōu)越性主要表現在：可直接用未經純化的樣品進行分析；樣品需求量少，通常只要數微升；靈敏度高，有利于檢出低豐度蛋白；高通量，可以快速發(fā)現多個生物標記物，實現自動化分析；有多種不同表面性質的芯片可供選擇，有利于發(fā)現一些具有特性的蛋白。所以SELDI-TOF-MS在蛋白質組學研究領域是對雙向電泳技術的有力補充。受目前常規(guī)檢測手段的局限，人們未能從整體上系統(tǒng)地分析精漿中的蛋白質群及其作用，因此針對精液異常的男性不育患者，進行精漿的系列比較蛋

5、白組學研究，確立與不育發(fā)生相關的重要蛋白質群，揭示關鍵蛋白的分子作用機制和相互作用網絡，是尋找不育原因的一條新思路。 本研究旨在利用蛋白質芯片-飛行時間質譜技術(SELDI-TOF-MS)這種新的蛋白組學研究方法，對精液液化延遲、非阻塞性無精癥、嚴重少精癥等多種男性不育癥患者精漿與正常可生育男性精漿進行檢測，比較正常與各不育組之間是否存在差異蛋白，差異蛋白的數量及相應的分子量。彌補常規(guī)2D-PAGE蛋白組研究方法對小分子質量、微

6、量蛋白無法檢測的缺陷。 研究方法: 本研究中以29例精液標本為研究對象，按WHO《不育標準檢查與診斷手冊》進行分類：其中精液正常組11例，精液液化延遲組7例，非阻塞性無精組6例，嚴重少精癥(偶見活精)組5例。精液標本離心后分離精漿。應用CM10蛋白芯片捕獲蛋白；蛋白質離子化后，用PBS IIC型蛋白質芯片閱讀機對不同組精漿蛋白進行檢測，獲得各樣本的蛋白指紋圖譜。應用BioMarker Wizard軟件對所測蛋白質進行歸一

7、化處理，Ciphergen ProteinChip Software 3.1軟件分別對精液液化延遲組與正常組、非阻塞性無精癥組與正常組、嚴重少精癥組與正常組、嚴重少精癥組與非阻塞性無精癥組進行統(tǒng)計學分析。比較幾組間存在的差異蛋白數量、強度。在Swiss-Prot和TrEMBL蛋白質庫中對P<0.01的差異蛋白進行初步篩選。 結果: 1.正常組與液化延遲組正常組與液化延遲組比較，有19個蛋白表達存在差異。 其中在液

8、化遲緩組表達較正常組高的蛋白有10個，其分子質量分別為：8696.621 Da，9770.076 Da，9512.309 Da，10202.64 Da，9617.759 Da，10119.41Da，12345.16 Da，12542.41 Da，9407.785 Da，16517.9 Da(P<0.05)；其中分子質量為8696.621 Da，9770.076 Da，9512.309 Da，10202.64 Da，9617.759 Da

9、的5個蛋白表達增高明顯，P<0.01。 在液化遲緩組表達降低的蛋白有9個，其分子質量分別為：2941.903 Da，2669.629 Da，2127.706 Da，2922.53 Da，2688.064 Da，3454.267 Da，3602.682 Da，7596.921 Da，7630.573 Da(P<0.05)；其中分子質量為2941.903 Da的蛋白質表達明顯降低，P<0.01。 蛋白質庫查詢P<0.01的幾

10、種差異蛋白，提示其中4種蛋白可能是：Zincfinger protein；谷胱甘肽轉移酶同功酶；動力蛋白輕鏈；細胞色素氧化酶多肽。 2.正常組與無精組正常組與無精組比較，有28個蛋白表達存在差異。 在無精組除分子質量分別為：5423.645 Da，9617.759 Da，10778.81 Da，5379.173 Da的四個蛋白質表達增高外，其余24個差異蛋白質表達均較正常組降低，P<0.05。其中分子質量分別為7196.

11、058 Da，7630.573 Da，7547.61 Da，7709.833 Da的4個蛋白含量明顯下降，有顯著性差異，P<0.01。 蛋白質庫查詢P<0.01的幾種差異蛋白，提示其中1種蛋白可能是：絲氨酸酶抑制因子Kazal型前體。 3.正常組與偶見活精組 正常組與偶見活精組蛋白表達差異不大，僅有兩個低豐度蛋白存在表達差異。均表現為在嚴重少精組表達降低，其分子質量分別為：2806.517 Da，15313.23

12、Da(P<0.05)。 4.偶見活精組與無精組偶見活精組與無精組相比，有15個蛋白存在表達差異。 在無精組表達增高的蛋白有6個，其分子質量分別為：10860.9 Da，5379.173Da，10202.64.Da，10778.81 Da，13788.28 Da，13856.4：Da(P<0.05)。 在無精組表達降低的蛋白有9個，其分子質量分別為：2647.87 Da，7196.058Da，7547.61 Da，

13、5780.493：Da，6393.921：Da，7013.909 Da，7059.844 Da，7409.589Da，8621.5 Da(P<0.05)。 結論: 1.蛋白質芯片-飛行時間質譜技術可以同時、快速對試驗組與對照組之間是否存在差異蛋白進行確定，并可同時檢測出多種差異蛋白標志物，是差異蛋白組學研究的較好方法。 2.在精液液化過程除了一些研究清楚的較大分子質量的蛋白質參與外，還有眾多小分子蛋白參與這一重要

14、的生理過程。其中4種蛋白可能是：Zinc finger protein；谷胱甘肽轉移酶同功酶；動力蛋白輕鏈；細胞色素氧化酶多肽。 3.絲氨酸酶抑制因子可能參與精子的發(fā)生過程。 創(chuàng)新: 1.首次用SELDI-TOF-MS技術對多種男性不育相關疾病的精漿進行檢測。 2.首次報道了精液液化延遲患者中還存在大量小分子蛋白質參與這一過程，可能包括Zinc finger protein；谷胱甘肽轉移酶同功酶；動力蛋白