轉(zhuǎn)錄因子RBP-J通過介導Notch信號調(diào)控神經(jīng)細胞分化.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育是脊椎動物胚胎發(fā)育過程中調(diào)控最復雜、次序最嚴謹?shù)氖录弧Ｅ咛ド窠?jīng)管中的神經(jīng)干細胞（neuralstemcells，NSCs）是一種維持自我更新的多潛能細胞，可以進一步分化為各種不同類型的神經(jīng)細胞。在神經(jīng)發(fā)育過程中，NSCs隨著發(fā)育階段的不同變換著它們的響應性和發(fā)育潛能。在早期擴增階段，神經(jīng)干細胞主要進行廣泛的增殖來擴大細胞群體。隨著發(fā)育的進行，一些神經(jīng)干細胞在區(qū)域性神經(jīng)誘導信號的作用下起始了原神經(jīng)基因（proneura

2、lgene）的表達。Proneuralgenes是一類堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（basichelix-loop-helix,bHLH）轉(zhuǎn)錄因子，如Mash1、Ngn1/2和Math1等，它們可以誘導神經(jīng)元特異性基因的表達，從而將多潛能的神經(jīng)干細胞決定到神經(jīng)元分化命運上來。隨著proneural基因的表達，神經(jīng)管中原本相對均一的NSCs群體開始形成差異。那些起始表達proneural基因的NSCs分化為神經(jīng)元前體細胞，而未表達proneura

3、l基因的細胞仍然維持干細胞狀態(tài)。隨后，神經(jīng)元前體細胞開始退出細胞周期，遷移至神經(jīng)管外側(cè)并分化為神經(jīng)元。而NSCs仍然維持未分化狀態(tài)直到神經(jīng)發(fā)生晚期，再在特定神經(jīng)誘導信號的作用下分化為晚期的神經(jīng)細胞類型，比如膠質(zhì)細胞。維持一個適當規(guī)模的NSCs群體對于神經(jīng)發(fā)育的正常進行至關(guān)重要，如果NSCs提前分化則會導致嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷。由于NSCs沒有得到充分的擴增，會最終導致神經(jīng)細胞總量的下降。同時，NSCs提前分化只產(chǎn)生早期的神經(jīng)細胞類型，

4、從而導致晚期神經(jīng)細胞類型的缺失，因而不能建立正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。除此以外，由于NSCs強大的分化潛能和自我更新能力，在醫(yī)學上還具有治療神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性變等疾病的潛能。
　　視網(wǎng)膜是研究神經(jīng)干細胞/神經(jīng)前體細胞（Neuralprogenitorcells,NPCs）增殖分化的優(yōu)異模型。在神經(jīng)發(fā)育早期，視網(wǎng)膜由間腦的神經(jīng)上皮向兩側(cè)形成突起發(fā)育而來，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)地一部分。在哺乳類神經(jīng)發(fā)育過程中，視網(wǎng)膜前體細胞（Retinalpro

5、genitorcells,RPCs）可以分化形成視網(wǎng)膜中的7種主要神經(jīng)細胞類型，這些不同的細胞類型在視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮增殖的同時依次分化出現(xiàn)：神經(jīng)節(jié)細胞、視錐細胞及水平細胞最先生成，接著是無長突細胞和視桿細胞，最后才是雙極細胞和Müller氏膠質(zhì)細胞。分化中的神經(jīng)細胞要遷移到適當?shù)奈恢?，以形成正確的細胞排列，并最終形成視網(wǎng)膜的五個組織層次，包括三個有核層(nuclearlayers)及將它們聯(lián)系在一起的兩個突觸層(synapticlayer

6、s)，從而完成光信號的接受、轉(zhuǎn)換和傳導。視網(wǎng)膜豐富的細胞類型和規(guī)則的層次結(jié)構(gòu)，是視覺功能實現(xiàn)的生物基礎(chǔ)。
　　與視網(wǎng)膜相同，小腦(cerebellem)特別是小腦皮層是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為高度有序的結(jié)構(gòu)之一。與大腦皮層相比，它的特征性和簡單性使其成為研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育機制的又一經(jīng)典模型。發(fā)育中過程中，由小腦室區(qū)和菱腦唇兩個生發(fā)中心分化出九型神經(jīng)細胞：包括浦肯野(氏)細胞、高爾基細胞、顆粒細胞、籃狀細胞、星形細胞和Lugaro細胞，單

7、極刷(形)細胞，和燭臺（狀）細胞，以及小腦特異性的Bergmann(氏)膠質(zhì)細胞。成熟的小腦皮層由這八型神經(jīng)元和一型膠質(zhì)細胞排列成精確的立體結(jié)構(gòu)，并形成復雜的神經(jīng)環(huán)路從而實現(xiàn)運動協(xié)調(diào)、技能學習等重要的生理功能。
　　在神經(jīng)發(fā)育過程中，NSC/NPCs的增殖和分化受到多個信號轉(zhuǎn)導途徑的精確調(diào)控。以細胞膜受體Notch、轉(zhuǎn)錄因子RBP-J及其下游效應基因組成的Notch信號途徑是調(diào)控發(fā)育過程的基本信號之一。雖然既往研究揭示出Notch

8、途徑在神經(jīng)細胞分化中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但操作Notch途徑不同分子得到的實驗結(jié)果具有差別，其發(fā)揮作用的下游靶點也存在爭議?；诟深A單個Notch受體或其下游基因的研究方法，不足以反映Notch信號功能的全貌。由于在哺乳動物中，Rbpj編碼的轉(zhuǎn)錄因子可以整合并傳遞來源于四型Notch受體的信號，從而激活下游基因轉(zhuǎn)錄。因此在本課題研究中，我們利用Cre-Loxp重組酶系統(tǒng)，在小鼠RPCs和小腦原基的NPCs中特異性剔除Rbpj基因。

9、>　　Rbpj敲除視網(wǎng)膜與野生型小鼠視網(wǎng)膜相比，出現(xiàn)明顯的發(fā)育障礙和視網(wǎng)膜層次結(jié)構(gòu)異常。視網(wǎng)膜發(fā)育早期，RPCs分化加速，表現(xiàn)為一系列proneural基因表達上調(diào)。然而，僅有神經(jīng)節(jié)細胞和感光細胞增多，中間神經(jīng)元數(shù)目減少，提示RBP-J缺失導致神經(jīng)元提前分化和RPCs的耗竭；發(fā)育晚期，通過活體電穿孔在出生后小鼠視網(wǎng)膜中敲除Rbpj主要導致視桿細胞增加和Müller氏膠質(zhì)細胞減少。提示RBP-J參與調(diào)控感光細胞和Müller氏膠質(zhì)細胞的定

10、向分化。此外，在Rbpj缺失的視網(wǎng)膜中，層狀結(jié)構(gòu)的紊亂伴隨著視網(wǎng)膜外表面細胞粘附相關(guān)分子β-catenin的表達缺失。更為有趣的是，我們通過活體電穿孔在Rbpj缺失的視網(wǎng)膜中過表達β-catenin，觀察到視網(wǎng)膜正常層次結(jié)構(gòu)的恢復。
　　Rbpj敲除小腦與野生型小鼠小腦相比體積顯著變小，分葉結(jié)構(gòu)消失。發(fā)育早期（E10.5、E12.5）小腦原基腦室區(qū)proneural基因Mash1表達上調(diào)，神經(jīng)元提前分化，增殖的NPCs顯著減少，表

11、明Notch-RBP-J信號途徑維持著小腦原基中NPCs的數(shù)量，并控制著小腦神經(jīng)細胞分化的時程。發(fā)育晚期浦肯野細胞和顆粒細胞持續(xù)性減少，小腦深部核團幾乎消失。此外，Rbpj敲除小鼠中決定菱腦峽組織者（IsthmicOrganizer）建立和中后腦分界形成的重要因子在相應區(qū)域均有表達，表明Rbpj表達失活對于IO的形成沒有顯著性影響，同時說明Notch-RBP-J信號途徑對于小腦原基發(fā)育的調(diào)控作用是直接的，而并非間接的通過調(diào)節(jié)IO建立而發(fā)

12、揮影響。
　　上述研究結(jié)果共同揭示RBP-J所介導的經(jīng)典Notch信號途徑通過抑制神經(jīng)細胞分化(differentiation)，從而維持足夠的NSC/NPCs直至晚期發(fā)育；此外，Notch-RBP-J信號也參與神經(jīng)細胞定向（specification），發(fā)揮諸如抑制視網(wǎng)膜感光細胞分化，以及促進Müller氏膠質(zhì)細胞形成的作用；在形態(tài)發(fā)生方面，RBP-J還可能通過調(diào)控粘附相關(guān)分子β-catenin的表達參與視網(wǎng)膜層次結(jié)構(gòu)形成；同時

13、，我們的研究證明RBP-J對于中后腦分界的形成沒有顯著影響。綜上所述，本課題的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子RBP-J通過介導經(jīng)典Notch信號途徑調(diào)控神經(jīng)細胞的定向、分化；并在特定發(fā)育環(huán)境中調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)形成，從而協(xié)調(diào)神經(jīng)發(fā)生（Neurogenesis）和形態(tài)形成（Morphogenesis）兩個發(fā)育過程，最終確保神經(jīng)系統(tǒng)正常的結(jié)構(gòu)形成及功能建立。這些研究對于深入理解神經(jīng)發(fā)育過程中的分子機理以及Notch信號全面的調(diào)控作用，以及了解相關(guān)人類