sPD-1協同IL-21抗小鼠肝細胞癌免疫的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:探索sPD-1對IL-21抗肝細胞癌免疫功能的影響,并對其作用機制進行初步研究。
   方法:
   1.重組質粒的構建及鑒定分離BALB/c小鼠脾細胞,ConA刺激后用RT-PCR方法擴增sPD-1cDNA及IL-21cDNA,克隆入真核細胞高效表達質粒pcDNA3.1中,構建重組真核表達質粒pcDNA3.1-sPD-1和pcDNA3.1-mIL-21。用脂質體2000將構建好的重組質粒分別轉染293細胞,用EL

2、ISA試劑盒檢測sPD-1及IL-21的表達;大量擴增sPD-1及IL-21的真核表達質粒。
   2.小鼠肝細胞癌模型的建立在BALB/c小鼠(雄性6~8周齡)的右后肢皮下接種100μL濃度為1×106個/mlH22細胞,成功構建小鼠的肝細胞癌模型。
   3.分組及干預措施隨即分為5組(每組8只),1)聯合組;2)sPD-1組;3)IL-21組;4)pcDNA3.1組;5)生理鹽水組。接種瘤細胞(對照組注入生理鹽水)

3、后第二天于注射部位瘤內注射重組質粒(對照組注入生理鹽水),每間隔兩天注射一次,共注射八次,質粒DNA濃度1ug/μL,注射量100μL/只(聯合組每種重組質粒各50μL)。
   4.指標檢測:(1)自注射日起,每隔三天測量各組小鼠腫瘤的長、短徑,計算注射后7d、14d、21d及28d時腫瘤體積。(2)于注射結束后,處死各組小鼠,取腫瘤組織,石蠟包埋并切片,蘇木素-伊紅(hematoxylin-esosin,HE)染色后光學顯微

4、鏡觀察;(3)免疫組織化學染色法檢測腫瘤組織PD-L1的表達情況。(4)ELISA法檢測各組小鼠血清中IL-2、IFN-γ及IL-10的量。(5)流式細胞術(FlowCytoMeter,FCM)檢測各組小鼠脾細胞中CD8+T細胞、NK細胞和調節(jié)性T細胞(Treg細胞)的數量。(6)分離各組小鼠的脾細胞,RT-PCR法從mRNA水平檢測脾細胞中IL-2、IL-10及IFN-γ的表達量。
   結果:
   1.PCR、酶切

5、、測序鑒定表明重組真核表達質粒pcDNA3.1-IL-21及pcDNA3.1-sPD-1構建成功。
   2.成功制備小鼠H22肝癌腹水瘤細胞,從腫瘤的生長情況及瘤細胞的HE染色證實了小鼠H22肝癌移植瘤模型的成功構建。
   3.免疫組化法證實了H22肝癌細胞高表達PD-L1分子。
   4.腫瘤生長曲線顯示sPD-1與IL-21聯合應用能明顯抑制腫瘤生長,與IL-21或sPD-1單獨應用相比差異有統(tǒng)計學意義(

6、P<0.05)。
   5.RT-PCR法及ELISA法顯示聯合組中IL-2及IFN-γ表達水平明顯高于其他各組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),相反聯合組中IL-10的表達水平最低,與其它組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<o.05)。
   6.流式細胞術檢測脾細胞中免疫細胞的變化,聯合治療組中CD8+T細胞及NK細胞的比例明顯升高,與IL-21或sPD-1單獨應用相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。抑制免疫反應的Tre

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