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文檔簡介
1、目的:
制備粒細胞樣髓源性抑制細胞(granulocytic myeloid-derived suppressor cells,G-MDSC)來源的exosomes(G-MDSC exo),研究G-MDSC exo的免疫抑制功能;觀察G-MDSC exo在葡聚糖硫酸鈉鹽(dextran sulfact sodium,DSS)誘導的小鼠炎性腸?。╥nflammatory bowel disease,IBD)中的作用及其機制。
2、r> 方法:
(1)G-MDSC exo制備及鑒定
構建荷瘤小鼠模型,磁珠分選G-MDSC并體外培養(yǎng),收集培養(yǎng)上清,聯(lián)合超速離心技術,膜超濾技術以及相關試劑制備G-MDSC exo。通過透射電子顯微鏡觀察G-MDSCexo的形態(tài)和大小,通過Western blot對G-MDSC exo表面分子CD63進行檢測,通過比色法檢測精氨酸酶1(arginase1,Arg-1)活性。
(2)G-MDSC exo的免
3、疫抑制功能檢測
磁珠分離小鼠脾臟CD4+T細胞,抗CD3/CD28抗體刺激其增殖,并在體系中加入不同劑量的G-MDSC exo,以中性粒細胞來源的exosomes(neutrophil derived exosomes,Neu exo)作陰性對照組,通過3H-胸腺嘧啶核苷([3H]-thymidine,3H-TdR)摻入法檢測各組CD4+T細胞增殖情況。利用雞卵白蛋白(ovalbumin,OVA)構建小鼠遲發(fā)型超敏反應(del
4、ayed type hypersersitivity, DTH)模型,在初次免疫后的第2天、第4天及第6天分別通過小鼠腹腔注射30μg G-MDSC exo,并以Neu exo作陰性對照,在第7天進行激發(fā)試驗,記錄激發(fā)后的24h、36h及72h小鼠足墊厚度,計算各時間點小鼠足墊腫脹情況。通過Arg-1抑制劑nor-NOHA(Nω-hydroxy-nor-Arginine,NN)阻斷G-MDSC exo中Arg-1活性后,再次利用T細胞增
5、殖試驗和DTH小鼠模型觀察Arg-1在G-MDSC exo免疫抑制功能中的作用。
(3)G-MDSC exo促進調節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)擴增磁珠分離小鼠脾臟CD4+T細胞,在抗CD3/CD28抗體活化下,用TGF-β誘導其向Treg細胞分化,在培養(yǎng)體系中加入不同劑量的G-MDSC exo或者Neu exo,培養(yǎng)72h后通過流式細胞術(flow cytometry,F(xiàn)CM)檢測CD4+CD2
6、5+Foxp3+ Treg細胞的比例。
(4)G-MDSC exo抑制小鼠IBD的發(fā)展
通過自由飲用2.5% DSS的方式誘導小鼠IBD,在飲水的第2天、第4天和第6天分別給小鼠腹腔注射30μg的G-MDSC exo,并以Neu exo作為陰性對照組。在實驗過程中,每天記錄小鼠的體重變化、糞便性狀及便血情況,計算各種小鼠不同時間的疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI);在飲用DSS的第8
7、天,處死小鼠,分離結腸組織,觀察結腸標本外觀并測量長度,蘇木伊紅(haematoxylin and eosin,HE)染色觀察炎癥浸潤情況并進行組織病理學評分。
通過流式細胞術分析小鼠腸系膜淋巴結中輔助T細胞1型(helper T cell type1,Th1)和Treg細胞在CD4+T細胞中的比例,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)檢測血清中腫瘤壞死因子α(t
8、umor necrosis factor-α,TNF-α)和干擾素γ(interferonγ,IFN-γ)水平。
結果:
(1)從G-MDSC培養(yǎng)上清中分離出G-MDSC exo;鑒定試驗結果顯示:G-MDSC exo為圓形或橢圓形的微囊狀結構,粒徑多為30-100nm,表達CD63分子,不表達鈣聯(lián)接蛋白(Calnexin),其裂解液中能檢測到Arg-1活性。
(2)在體外,CD4+T細胞增殖體系中,60、
9、90μg/ml G-MDSC exo處理組的每分鐘脈沖數(shù)(counts per minute,CPM)低于空白對照組和Neu exo處理組(P<0.01或P<0.05),而30μg/ml G-MDSC exo組沒有明顯變化(P>0.05)。在Arg-1阻斷實驗中,60、90μg/ml(G-MDSC+NN) exo處理組的CPM均低于G-MDSC exo處理組(P<0.05)。結果表明在體外G-MDSC exo可有效抑制CD4+T細胞增殖
10、,IFN-γ分泌,并且這種抑制效應與G-MDSC exo中Arg-1分子有關。
在小鼠DTH實驗中,激發(fā)后24h、48h和72h,G-MDSC exo處理組小鼠的足墊腫脹程度明顯低于Neu exo或(G-MDSC+NN) exo處理組(P<0.01或P<0.05),表明G-MDSC exo可有效減輕小鼠DTH反應。
(3)60μg/ml或90μg/ml G-MDSC exo處理組Treg細胞比例明顯高于空白對照組(P
11、<0.01或P<0.05),而30μg/ml G-MDSC exo處理組無明顯增加(P>0.05),并且G-MDSC exo呈劑量依賴性地增加誘導體系中Treg細胞的百分比。
(4)造模第6、7天,較Neu exo或(G-MDSC+NN)exo處理組,G-MDSC exo處理組小鼠DAI均下降(P<0.05);造模第8、9及10天,較Neu exo處理組,G-MDSCexo處理組小鼠DAI均顯著減少(P<0.01),較(G-M
12、DSC+NN) exo處理組,G-MDSCexo處理組小鼠DAI均減少(P<0.05)。
造模第8天,較Neu exo處理組,G-MDSC exo處理組小鼠結腸充血腫脹程度,結腸縮短程度,炎癥細胞浸潤程度及病理評分均減輕或明顯減輕(P<0.05或P<0.01),而(G-MDSC+NN) exo處理組較G-MDSC exo處理組上述各指標均增加均增加(P<0.05)。表明G-MDSC exo能有效改善小鼠IBD,并且與Arg-1
13、有關系。
造模第8天,較Neu exo處理組,G-MDSC exo處理組小鼠腸系膜淋巴結中Th1細胞比例減少(P<0.05),Treg細胞比例增多(P<0.05),血清TNF-α和IFN-γ水平下降(P<0.05);較G-MDSC exo處理組,(G-MDSC+NN) exo處理組小鼠腸系膜淋巴結中Th1細胞比例增加(P<0.05),Treg細胞比例無明顯變化(P>0.05),血清TNF-α和IFN-γ水平下降(P<0.05)
14、。表明G-MDSC exo通過抑制Th1介導炎癥反應及促進Treg細胞從而有效抑制小鼠IBD,并且這種抑制作用與Arg-1有關。
結論:
(1)成功制備G-MDSC exo;證明G-MDSC exo能抑制CD4+T細胞增殖和DTH反應,并且一定程度上依賴于Arg-1;并且G-MDSC exo能有效增加體外誘導體系中Treg細胞的比例。
(2)G-MDSC exo可有效減輕小鼠IBD的疾病程度,這與其抑制Th
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