受體介導的葉酸-牛血清白蛋白腫瘤細胞靶向給藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴重危害人類生命和健康的常見病和多發(fā)病。已有研究發(fā)現(xiàn)葉酸受體在多種腫瘤(如卵巢癌、肺癌、宮頸癌、乳腺癌、結直腸癌和腎細胞癌等)細胞膜上高度表達，而在正常組織上低表達甚至不表達。因此可利用葉酸受體與配體結合誘導細胞內化，將藥物攝取入真核細胞胞漿，增加藥物在病灶局部的濃度，降低毒副作用，達到靶向治療目的。 本課題以長春新堿(VCR)作為模型藥物，牛血清白蛋白(BSA)為載體材料，葉酸(FA)為靶頭，制備葉酸受體介導的腫瘤細

2、胞靶向給藥系統(tǒng)。 首先采用去溶劑化-交聯(lián)法制備長春新堿的牛血清白蛋白納米粒(VCR-BSA-NP)，以VCR在納米粒中的包封率為評價指標，通過正交試驗設計得到優(yōu)化處方與制備工藝(VCR與BSA的濃度比1:20、溶液pH=7，戊二醛體積0.075ml，固化時間10h)。優(yōu)化工藝所制備的納米粒包封率穩(wěn)定；呈類球形體，表面光滑，平均粒徑為200nm；成球率較高，絕大部分的輔料BSA能形成微粒；釋藥過程呈現(xiàn)一定的緩釋效果，但是前期有個突

3、釋階段；長期放置，則穩(wěn)定性不太好。 根據(jù)FA偶聯(lián)至BSA上的時機不同，分別制備了兩種類型的VCR-FA-BSA-NP。Ⅰ型為在載體成球前連接配體，即先將FA偶聯(lián)至BSA表面，然后由FA-BSA制備VCR-FA-BSA-NP；Ⅱ型為在載體成球后連接配體，即先制備VCR-BSA-NP，然后再將FA偶聯(lián)至BSA上。經過考察發(fā)現(xiàn)：Ⅱ型微粒較Ⅰ型微粒分布更均勻且粒徑稍小，Ⅰ型微粒約為250nm，Ⅱ型微粒則約為210nm；Ⅰ型微粒的葉酸偶聯(lián)

4、率(76.18μg/mg)明顯高于Ⅱ型微粒的葉酸偶聯(lián)率(65.09μg/mg)；Ⅰ型微粒的包封率(84.97％)與Ⅱ型微粒的包封率(87.01％)相當，沒有明顯差別；Ⅰ型VCR-FA-BSA-NP在釋藥初期有一定程度的突釋，隨后較平緩，而Ⅱ型VCR-FA-BSA-NP則一直釋放平緩。 采用MTT法評價牛血清白蛋白載藥納米粒(VCR-BSAμNP)、葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白載藥納米粒(VCR-FA-BSA-NP)和長春新堿原料藥(VC

5、R)對人子宮頸癌HeLa細胞、人結腸癌CaCo-2細胞和猴腎細胞COS-1的細胞毒性。試驗結果顯示：各型VCR藥劑對三種細胞的毒性均有差異，且都表現(xiàn)出顯著的濃度依賴性，藥物濃度越大則毒性越強；對于Hela細胞和CaCo-2細胞，各型VCR藥劑的細胞毒程度依次為VCR＜VCR-BSA-NP＜Ⅰ型VCR-FA-BSA-NP＜Ⅱ型VCR-FA-BSA-NP，其中Ⅰ、Ⅱ型VCR-FA-BSA-NP的細胞毒性卻差異不大；游離VCR藥物對正常細胞也

6、具有很強的細胞毒性，而BSA-VCR-NP并沒有改善這種對正常細胞的抑制殺傷作用，但是Ⅰ、Ⅱ型VCR-FA-BSA-NP對COS-1細胞的抑制率卻較VCR-BSA-NP明顯改善；FA的引入使得載體連接的FA和腫瘤細胞表面的葉酸受體結合產生一定的靶向作用，導致了更多腫瘤細胞被殺傷，因此VCR-BSA-NP對腫瘤細胞的毒性明顯增強，并且Hela細胞的藥敏性比CaCo-2細胞的藥敏性強。 用異硫氰酸熒光素(FITC)標記牛血清白蛋白和

7、葉酸偶聯(lián)的牛血清白蛋白，以正常的猴腎細胞COS-1及表面表達有葉酸受體的人子宮頸癌HeLa細胞、人結腸癌CaCo-2細胞為模型細胞，進行細胞攝取機理研究。熒光倒置顯微鏡結果表明，F(xiàn)A-BSA-NP對腫瘤細胞具有主動靶向作用，細胞對它的攝取是通過腫瘤細胞表面豐富的葉酸受體介導產生的，而且由于受體-配體結合存在競爭性抑制作用，F(xiàn)A-BSA-NP的主動靶向性也可以被游離FA顯著抑制甚至完全被阻斷從而回歸到BSA-NP的狀況。 葉酸受體