多維液相色譜質譜聯(lián)用技術及其在人類肝臟蛋白質組學研究中的應用.pdf

1、肝臟是人體最大的實質器官之一，是人體物質代謝、能量轉換及供應的中心，在人體的生命活動中占有重要地位；同時，肝臟也是常見的病原體持續(xù)感染的場所，因此，對肝臟蛋白質組的研究有助于人們對肝臟正常生理功能以及肝臟疾病機制的深入了解。本文主要是以多維液相色譜質譜聯(lián)用技術為研究平臺，以肝臟組織為研究對象，對蛋白質組學研究中的一些基本問題：如生物樣品的分離，質譜鑒定的重現(xiàn)性，低豐度蛋白質的質譜檢測，鑒定結果的可信度以及質譜數(shù)據(jù)的充分挖掘與利用等方面作

2、系統(tǒng)的研究，為進一步的規(guī)?；鞍踪|學研究提供參考。 蛋白質組學的基本目標是盡可能的鑒定到生物體所表達的全套蛋白質，隨著質譜技術的發(fā)展和完善，高通量地分析生物體的蛋白質組成已經(jīng)成為可能。但是生物樣品的高度復雜性嚴重干擾了蛋白質的質譜鑒定。因此有必要對生物樣品進行預分離以簡化樣品組成。在第二章中，搭建和優(yōu)化了液相色譜質譜平臺，從蛋白質水平和蛋白的酶切肽段水平分別對生物樣品進行預分離。在蛋白質水平，我們優(yōu)化了反相色譜(RPLC)對復雜

3、生物樣品的分離效果。在肽段水平，搭建了離線的SCX-RPLC兩維液相色譜體系。我們利用建立的多維液相色譜質譜技術平臺，采取重復多次運行策略構建了目前世界上規(guī)模最大的人類肝臟蛋白質組表達譜。通過6次重復的實驗，共獲得了6,000,000余張二級質譜圖，通過SEOUEST軟件對人類蛋白質IPI3.07數(shù)據(jù)庫進行檢索，在90％的可信度水平下共鑒定到35658個去冗余肽段，用Buildsummary軟件合并后，共得到13150個去冗余蛋白質(或

4、蛋白質Group)，其中雙肽段以上匹配蛋白質為7001個。 對雙肽段匹配蛋白質的理化性質、功能及亞細胞定位進行了全面分析，說明重復“Shotgun”策略是一種高通量、高靈敏度的蛋白質組研究策略。同時我們也分析了蛋白質被質譜檢測頻次與蛋白質豐度之間的關系，通過重復的ESI-RPLC-MS/MS技術可以鑒定更多的低豐度蛋白質。另外，相同的蛋白質在不同批次中被鑒定也起到相互印證的作用，從而增加鑒定結果的可信度。在規(guī)?；鞍踪|組學研究中

5、，鑒定結果的可靠性越來越受到人們的關注。在第三章中，應用全新的LTQ-FTICR質譜儀器，對質量準確度對鑒定結果可信度的影響進行了研究。質譜儀器的質量準確度是質譜儀器的關鍵參數(shù)，在蛋白質的定性分析中起重要作用，對LTO，F(xiàn)T-full(全掃描模式)及FT-SIM(選擇離子監(jiān)控模式)三種質譜采集模式下的分辨率，質譜掃描時間，質量準確度進行了考察，分析了不同質量準確度數(shù)據(jù)在數(shù)據(jù)庫檢索中可信度過濾參數(shù)的變化，高質量準確度條件下鑒定肽段的del

6、taCn值普遍升高，Xcorr值下降。研究表明，鑒定結果的可信度與質譜數(shù)據(jù)的質量準確度和母離子質量誤差設置密切相關。對FT的數(shù)據(jù)進行了Sequest和Mascot算法的比較，肽段和蛋白的重疊率均在70％以上。這兩種軟件均可用于FT數(shù)據(jù)的檢索，但mascot對質量準確度更為敏感。基于以上分析，獲得了一組高可信度、高質量準確度的中國人健康肝臟蛋白質組數(shù)據(jù)集(4898個蛋白質，2640個蛋白質Group)。 質譜數(shù)據(jù)中蘊藏著豐富的信息

7、，對質譜數(shù)據(jù)的充分挖掘是當前蛋白質組研究的難點。SNPs是人類基因組中最為常見的一種遺傳多態(tài)性，具有數(shù)量多、分布廣和穩(wěn)定遺傳等特點，它與生物個體差異和許多疾病直接相關，是決定人類疾病易感性和藥物反應差異的主要因素。長期以來，對SNP的發(fā)掘和鑒定一直是以基因水平的分析為基礎的。在第四章中，首次提出了一套完整的基于液質聯(lián)用質譜數(shù)據(jù)的肽段nsSNP位點發(fā)掘的策略和技術路線。利用構建的肽庫，對先前的質譜數(shù)據(jù)進行了重新解析，發(fā)現(xiàn)了一系列由于nsS

8、NP導致的氨基酸突變的肽段和蛋白質，從而在蛋白質水平驗證了這些SNP的存在。 在前期工作中，發(fā)現(xiàn)生物樣品中蛋白質的豐度確實與該蛋白質的酶解肽段被質譜儀檢測到的頻率有關系。在第五章中，基于建立的液質聯(lián)用平臺，利用相對簡單的酵母體系建立了根據(jù)差異樣品中共同鑒定蛋白質的肽段檢測頻率的比值來發(fā)現(xiàn)差異蛋白尋找生物標志物的方法，并對不同歸一化方法進行了比較分析，并將建立的非標定量方法成功地應用于肝癌細胞模型HepG2和HepG2-HBx細胞