酪氨酸蛋白激酶抑制劑(AG490)對血管內皮細胞作用影響的實驗研究.pdf

1、前言：血管瘤是嬰幼兒最常見的良性腫瘤,據報道,嬰幼兒血管瘤的發(fā)病率可高達10％,體重低于1000g的早產兒發(fā)病率高達22.9％。血管瘤的發(fā)病率有種族差異,白人的發(fā)病率高于其他種族,黑人的發(fā)病率最低;血管瘤的發(fā)病率也有性別差異,女性的發(fā)病率高于男性,比例約為3:1。血管瘤大多數(71％)位于頭頸部,位置比較表淺,也有少數發(fā)生在黏膜、肌、骨組織和內臟,不僅影響美觀,而且影響生理功能,甚至危及生命。血管瘤是以血管內皮細胞活躍增殖為特征的良性腫

2、瘤,且大多數血管瘤有一個快速增生和自然消退的過程。血管瘤一般在出生時并不存在,大多數出現在出生后1月內。早期血管瘤生長迅速,超過嬰兒的生長速度,然后緩慢消退。根據其分子標志、生長特點及患者年齡,臨床上通常將其分為3期:快速增殖期(0-1歲)、消退期(1-5歲)和消退完成期(5-12歲)。血管瘤在經過一個始發(fā)的快速增殖期后,血管內皮細胞增殖速度減慢,腫瘤內細胞成分減少,并逐漸被纖維脂肪組織所取代。約有50％的患者,瘤體在5歲時可完全消退,

3、至12歲時總的消退率達90％。
　　 目前國內外治療血管瘤的方法主要有外科切除、放射治療、低溫治療、激光治療、硬化劑注射、抗癌藥物治療、類固醇激素治療等。目前,一種新型的治療手段-普奈洛爾治療血管瘤正逐漸被廣泛應用,且取得了較好的臨床效果,但其具體的治療機制,還處于研究階段。而外科切除也只能針對小面積血管瘤,且術中出血量大,術后面部外形、功能難以恢復正常,給這些嬰幼兒血管瘤患者的身心健康帶來極大的影響。
　　 目前,血管

4、瘤的發(fā)病機理仍在探討中,其中生長因子與血管瘤的關系受到越來越多學者的關注。Bobling等人報道血管瘤內皮細胞及基質細胞自分泌堿性成纖維生長因子、血小板衍化生長因子、血管內皮生長因子、表皮生長因子等多種生長因子,并且有相應的受體表達。生長因子作用于細胞膜受體上,通過激活酪氨酸蛋白激酶,使其磷酸化,啟動Ras-MAPK(細胞分裂原活化蛋白激酶)級聯反應,c-fos、ras、myc等原癌基因表達,某些蛋白質合成迅速增加,細胞進入S期,迅速分

5、裂增殖。
　　 鑒于多種生長因子參與血管瘤的生長與增殖,因此單獨采用某一種生長因子的單克隆抗體來抑制血管瘤的生長是不可取的。本研究試圖通過多種生長因子發(fā)揮作用的共同中心環(huán)節(jié)—即抑制受體酪氨酸蛋白激酶的活性,使其不能磷酸化,啟動細胞增殖的信號不能連續(xù)向下傳導,從而抑制血管瘤內皮細胞及基質細胞的生長增殖。且所采用Tyrphostins AG490制劑細胞毒性小,降低了對正常細胞的毒性,安全可靠,達到治療的目的。
　　 材料和

6、方法：
　　 1、樣本的收集收集中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院病理科2005-2007年皮膚血管瘤存檔蠟塊30例和同期血管畸形蠟塊26例;收集中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院新生兒外科6個月以內的新生兒皮膚血管瘤3例;6例6個月以內唇裂患兒裂隙周邊正常皮膚取自中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院口腔頜面外科手術切除標本;臍靜脈內皮細胞(HUVEC)購于上海生科生物科技有限公司。
　　 2、免疫組化
　　 標本切成5um切片,常規(guī)脫蠟至水,高壓抗原修

7、復。Hydrogen Peroxide Block中孵育30min。滴加適當濃度一抗,4℃過夜,滴加酶標二抗,DAB顯色。
　　 3、細胞培養(yǎng)
　　 HUVEC培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基+10％胎牛血清+100units/ml青霉素+100mg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中,置于35℃,5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 4、MTT分析對數增長期的HUVEC細胞以5×103細胞每孔加入96孔細胞培養(yǎng)板,于37℃,5％CO2過夜

8、培養(yǎng)。次日細胞貼壁后,吸棄培養(yǎng)基上清,換液為含AG490終濃度分別為0、10、20、30、60、120、240μM的無血清DMEM培養(yǎng)液,每孔200μl,同時設立空白組,分別培養(yǎng)24h、48h、72h進行MTT檢測,每孔加入DMSO溶液200ul,室溫下震蕩10min,選擇490nm波長,在酶聯免疫檢測儀上檢測。
　　 5、Realtime PCR檢測將獲得的總RNA,使用TIANScript RT Kit試劑盒按照說明書進行r

9、eal-timePCR檢測。PCR反應條件95℃10min,95℃10s,60℃20s,72℃30s,4℃5min,35個循環(huán)。VEGF特異性引物:5’-CCTGAAATGAAGGAAGAGGAGACT-3’/5’-CTCGGTGATTTAGCAGCAAGA-3’。COX-2特異性引物:5’-TCCCCTTCTGCCTGACACCT-3’/5’-TTCCTACCACCAGCAACCCT-3’。反應結束后分析real-TimePCR的擴增

10、曲線和融解曲線,用2-△△CT法進行相對定量分析。
　　 6、Western blot鑒定使用VEGF、COX-2和p-KDR抗體進行western blot實驗,以檢測VEGF、COX-2和p-KDR蛋白的表達。組織及細胞樣本的蛋白提取,蛋白樣本的制備,進行SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜,封閉,雜交,顯色。
　　 7、Hoechst33258染色檢測細胞凋亡取對數增長期的HUVEC細胞加入6孔細胞培養(yǎng)板,于37℃,5％

11、CO2過夜培養(yǎng)。次日細胞貼壁后,吸棄培養(yǎng)基上清,換液為含AG490終濃度分別為0、30、60、120μM的無血清DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)48h,Hoechst33258染色,共聚焦顯微鏡下觀察,進行圖像采集。
　　 8、流式檢測細胞周期取對數增長期的HUVEC細胞,加入含AG490終濃度分別為0、30、60、120μM的無血清DMEM培養(yǎng)液,于37℃,5％CO2培養(yǎng)48小時。然后進行細胞固定、染色,進行流式堅持測。
　　 結

12、果：
　　 1、經免疫組織化學染色、real-time PCR和western blot檢測發(fā)現,VEGF、COX-2和p-KDR在血管瘤組織中高表達,與在血管畸形和正常皮膚組織中的表達有明顯差異(P＜0.05)。
　　 2、經Real-time PCR和Western blot檢測發(fā)現,HUVEC中VEGF和COX-2mRNA及蛋白的表達與正常皮膚組織之間存在明顯差異(P＜0.05),與血管瘤之間無明顯差異(P＞0.0

13、5)。
　　 3、MTT和Western blot實驗發(fā)現,AG490可明顯抑制HUVEC的增殖;隨著AG490濃度增加,對HUVEC細胞增殖抑制作用顯著提高,VEGF、COX-2和p-KDR的蛋白表達有明顯下降的趨勢;同時,隨著加藥處理時間延長,抑制作用也存在上升的趨勢。但濃度過高、作用時間過長導致細胞死亡較多,得出AG490濃度為30、60、120μM作用下,時間為48 h為最佳作用濃度和最佳作用時間。
　　 4、H

14、oechst33258染色結果發(fā)現與正常未加藥對照組相比,HUVEC細胞經AG490處理后,出現細胞核濃縮現象,呈現致密濃染,說明出現細胞凋亡情況;當AG490濃度達到120μM時,核染色質凝集成月牙形,細胞凋亡加劇。
　　 結論：實驗證實了VEGF、COX-2和p-KDR在小兒血管瘤的血管內皮細胞中高表達,并且與血管畸形內皮細胞及正常皮膚組織上的表達有顯著性差異,提示它們可能在血管瘤的增殖及其生物學行為中起重要作用。