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文檔簡介
1、卵巢癌在女性生殖器官惡性腫瘤中死亡率居首位,近年來,盡管化療取得了重要進展,但5年生存率仍無明顯提高,因此尋找治療卵巢癌的新型藥物及新型作用靶點已成為迫切的需要。
Genistein又稱染料木黃酮,最初是從大豆中提取出來的一種植物雌激素,作為酪氨酸蛋白激酶的特異性抑制劑,近年來國內外許多研究表明它可抑制乳腺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、卵巢癌等多種腫瘤的生長。我們的前期研究已證實,genistein對卵巢癌CAOV3細胞的增殖具
2、有抑制作用。王心等通過胃灌注人卵巢癌裸鼠移植瘤模型20例的研究表明,genistein可通過抑制卵巢癌細胞增殖和微血管生成發(fā)揮抑瘤作用。本研究選用臨床上常用的腹腔注射給藥途徑,探討genistein對人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及對細胞周期蛋白cyclinB1、cyclinD1表達的影響。
材料和方法:
一、材料
1、研究對象
人卵巢癌HO-8910細胞購自于上海生命科學院細胞
3、資源中心。BALB/c遺傳背景的、nu/nu雌性裸鼠作為實驗動物,4-6周齡,體重18-22g,購自上海斯萊克實驗動物中心,飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級環(huán)境中。
2、主要儀器
超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、冰箱、倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)、離心沉淀機、恒溫振蕩器、游標卡尺、電子分析天平、水平搖床、電泳儀、轉印電泳槽、垂直板電泳裝置、紫外分光光度計、凝膠電泳成像分析系統(tǒng)。
3、主要試劑
4、 Genistein、DMEM培養(yǎng)基、DMSO、PBS緩沖液、胰蛋白酶、小牛血清、青霉素、鏈霉素、鼠抗人cyclinB1單克隆抗體、鼠抗人cyclinD1單克隆抗體、堿性磷酸酶標記山羊抗鼠第二抗體、堿性磷酸酶顯色試劑盒、o-dianidine、β-naphthylacidphosphate、硝酸纖維素膜、十二烷基磺酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺(Acr)、甲醇。
二、方法
1、藥品
5、配置
Genistein用二甲基亞砜(DMSO)配成儲備液,置于-20℃保存。實驗時用DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。
2、細胞培養(yǎng)
人卵巢癌HO-8910細胞在含10%小牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中貼壁生長,于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。
3、卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立
用DMEM加10%小牛血清培養(yǎng)人卵巢癌HO
6、-8910細胞,細胞按1×107/mL懸浮于無血清培養(yǎng)基中,每只裸鼠右腋下皮下接種0.2mL,約7-10天可形成肉眼可見的瘤塊,直至瘤塊長至直徑約5mm時開始腹腔給藥。
4、動物實驗
通過建立人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型,探討genistein對卵巢癌是否具有抑制作用。
5、Westernblot法
檢測genistein對人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤組織中cyclinB1、cyclinD
7、1蛋白表達的影響。
6、統(tǒng)計學方法
應用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0對成組計量資料組間差異進行t檢驗,P<0.05差異有顯著性。
結果:
1、人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及genistein對其是否具有抑制作用的研究:成功建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型,腹腔注射給藥等實驗過程順利,將genistein各劑量組與對照組作比較,genistein低、中、高劑量組移植瘤生長抑制均顯著(P
8、<0.05)。
本實驗每天給予荷瘤裸鼠不同劑量的genistein連續(xù)治療21天,治療過程中及治療后觀察荷瘤裸鼠的生長、活動、飲食等一般狀態(tài)未見明顯異常,治療前、后體重無顯著差異(P>0.05)。
2、Genistein對人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤組織中cyclinB1和cyclinD1蛋白的表達的影響:Westernblot結果顯示,與對照組比較,genistein低、中、高劑量組處理后cyclinB1蛋白表達
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