復(fù)合環(huán)孢素同種異體骨體外藥物釋放、修復(fù)骨缺損效果及移植后免疫學(xué)研究.pdf

1、研究目的：
　　 骨修復(fù)材料中,相比于自體骨和人工假體,同種異體骨具有來(lái)源豐富,不受大小、形態(tài)限制,具有生物活性的特點(diǎn),臨床應(yīng)用前景較好。但目前骨庫(kù)常用同種異體骨的制備方法不能完全消除其免疫原性,且會(huì)對(duì)同種異體骨的成骨性能及生物力學(xué)性能產(chǎn)生損害。鑒于此,裴國(guó)獻(xiàn)、陸海波采用復(fù)合環(huán)孢菌素并低溫等離子體滅菌的方法制備了復(fù)合環(huán)孢菌素的同種異體骨(CAB),并申請(qǐng)到國(guó)家發(fā)明專利(一種新型同種異體骨及其制備方法,200610122058)。

2、本實(shí)驗(yàn)?zāi)康?(1)對(duì)CAB的體外藥物釋放特性進(jìn)行評(píng)價(jià),考察其藥物負(fù)載方式及負(fù)載量是否合理；(2)對(duì)CAB與骨庫(kù)常用凍干同種異體骨(FDAB)的骨缺損修復(fù)效果及植入后引發(fā)的免疫反應(yīng)進(jìn)行比較研究。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 第一部分 復(fù)合環(huán)孢素同種異體骨體外藥物釋放研究
　　 1 空氣栓塞處死新西蘭兔4只,無(wú)菌條件下切取雙側(cè)髂骨。經(jīng)清洗、切削、打磨制成松質(zhì)骨塊。參照文獻(xiàn)方法制備CAB:室溫下30％雙氧水浸泡24 h脫蛋白

3、,再以氯仿、甲醇、水各90、90、20ml為萃取劑,水浴溫度為65℃,在索氏脂肪萃取器中連續(xù)脫脂48 h。將上述脫蛋白脫脂骨浸于0.6 ml95％乙醇溶液中,室溫下振蕩90 min,5000 r/min離心20 min,37℃恒溫箱中干燥12 h,稱重得質(zhì)量M1,再將上述骨塊浸于0.6ml環(huán)孢素乙醇溶液(環(huán)孢素在95％乙醇中的濃度為0.5 g/L)中,室溫下振蕩90 min,5000 r/min離心20 min,37℃恒溫箱中干燥12

4、h,制得CAB,稱重得質(zhì)量M2,CAB上負(fù)載藥物的質(zhì)量為M2與M1之差,平均0.0998 g。
　　 2 取上述脫蛋白脫脂骨及CAB,臨界點(diǎn)干燥后噴金,進(jìn)行掃描電鏡觀察。
　　 3 以300mL含0.2％SDS的生理鹽水為溶出介質(zhì),37℃±5℃、轉(zhuǎn)速70 r/min條件下恒溫振蕩器中分別對(duì)5塊CAB進(jìn)行藥物釋放實(shí)驗(yàn)。于規(guī)定時(shí)間取樣2ml,每次取樣后立即補(bǔ)充同溫度同體積的新鮮介質(zhì)。樣品5000 r/min離心2 min,取

5、上清液進(jìn)行HPLC測(cè)定,計(jì)算藥物濃度及累計(jì)溶出百分率。數(shù)據(jù)為5組數(shù)據(jù)的平均值。色譜條件:色譜柱(Agilent C18,4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相:甲醇:水(85:15),流速:1.0mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng):210nm,柱溫55℃,進(jìn)樣體積20 μl。
　　 第二部分 復(fù)合環(huán)孢菌素同種異體骨與凍干同種異體骨移植后免疫學(xué)比較
　　 1 60只新西蘭兔隨機(jī)分為3組:材料提供組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組,每組20只。

6、材料提供組動(dòng)物空氣栓塞處死,無(wú)菌條件下切取雙側(cè)髂骨。經(jīng)清洗、切削、打磨制成松質(zhì)骨塊,骨塊隨機(jī)分為兩組,每組20塊。一組參照文獻(xiàn)方法制備CAB:室溫下30％雙氧水浸泡24 h脫蛋白,再以氯仿、甲醇、水各90、90、20 ml為萃取劑,水浴溫度為65℃,在索氏脂肪萃取器中連續(xù)脫脂48 h。將上述骨塊浸于0.5 g/L環(huán)孢菌素乙醇溶液中,室溫下振蕩90 min,5000 r/min離心20 min,37℃恒溫箱中干燥12 h,真空封裝后行低溫

7、等離子體滅菌。另一組參照文獻(xiàn)方法制備FDAB:材料被4℃冷藏30 min,-20℃冷凍12 h,-70℃深凍7 d,然后于冷凍干燥機(jī)中凍干24 h,凍干結(jié)束后材料殘余水量低于6％。真空封裝后,材料經(jīng)60C0γ射線行輻照滅菌,輻照劑量為25 kGy,輻照時(shí)間為17 h。兔耳緣靜脈麻醉(3％戊巴比妥鈉30 mg/kg)。嚴(yán)格無(wú)菌條件下截取右側(cè)橈骨中段10 mm骨,同時(shí)去除該段骨膜及骨間膜,造成完全性骨缺損。實(shí)驗(yàn)組植入CAB修復(fù),對(duì)照組植入F

8、DAB修復(fù)。依次縫合肌層皮膚,無(wú)菌包扎。術(shù)后每天以青霉素肌注,連續(xù)3d,常規(guī)飼養(yǎng)。
　　 2 分別于術(shù)后2、4、8、12周各處死每組動(dòng)物5只,處死前耳緣靜脈分別采血1.5 ml于肝素抗凝采血管中。處死后于清潔條件下迅速解剖取出右側(cè)橈骨原缺損范圍內(nèi)骨組織段,將其分為近端、遠(yuǎn)端、中間三段,分別切取100 mg骨塊。所取血液、骨組織置-80℃保存。吸取血標(biāo)本1 ml于1.5 ml離心管中,5000 r/min離心3 min,取上清10

9、0 μl按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作分別測(cè)定IL-2、TNF-αOD值。300 mg骨標(biāo)本中加入3 mlPBS液,搗碎勻漿機(jī)制成勻漿,吸取勻漿液1 ml于1.5ml離心管,5000 r/min離心3 min,取上清100μl按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作分別測(cè)定IL-2、FNF-αOD值。IL-2試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法原理,OD值越高,濃度越?。籘NF-α試劑盒采用夾心法原理,OD值越高,濃度越高。
　　 第三部分 復(fù)合環(huán)孢菌素同種異體骨與凍干同種異體骨

10、修復(fù)骨缺損效果比較
　　 1 45只新西蘭兔隨機(jī)分為3組:材料提供組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組,每組15只。材料提供組動(dòng)物空氣栓塞處死,無(wú)菌條件下切取雙側(cè)髂骨。經(jīng)清洗、切削、打磨制成松質(zhì)骨塊,骨塊隨機(jī)分為兩組,每組15塊。一組參照文獻(xiàn)方法制備CAB:室溫下30％雙氧水浸泡24 h脫蛋白,再以氯仿、甲醇、水各90、90、20 ml為萃取劑,水浴溫度為65℃,在索氏脂肪萃取器中連續(xù)脫脂48 h。將上述骨塊浸于0.5 g/L環(huán)孢菌素乙醇溶液中,

11、室溫下振蕩90 min,5000 r/min離心20 min,37℃恒溫箱中干燥12 h,真空封裝后行低溫等離子體滅菌。另一組參照文獻(xiàn)方法制備FDAB:材料被4℃冷藏30 min,-20℃冷凍12 h,-70℃深凍7 d,然后于冷凍干燥機(jī)中凍干24 h,凍干結(jié)束后材料殘余水量低于6％。真空封裝后,材料經(jīng)60Coγ射線行輻照滅菌,輻照劑量為25 kGy,輻照時(shí)間為17 h。兔耳緣靜脈麻醉(3％戊巴比妥鈉30 mg/kg)。嚴(yán)格無(wú)菌條件下截

12、取右側(cè)橈骨中段10 mm骨,同時(shí)去除該段骨膜及骨間膜,造成完全性骨缺損。實(shí)驗(yàn)組植入CAB修復(fù),對(duì)照組植入FDAB修復(fù)。依次縫合肌層皮膚,無(wú)菌包扎。術(shù)后每天以青霉素肌注,連續(xù)3d,常規(guī)飼養(yǎng)。
　　 2 術(shù)后1、3、6月,每組各取5只動(dòng)物行空氣栓塞處死。攝取右橈骨正位X線片。采用Lane-Sandhu法X射線攝片評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。解剖、剝離右側(cè)尺橈骨進(jìn)行大體觀察后,截取植骨區(qū)骨段以10％中性福爾馬林固定,20％甲酸脫鈣,70％～10