基于液質聯(lián)用法的蛋白絕對定量技術開發(fā)及其在單抗類藥物臨床前藥代動力學研究中的應用.pdf

1、雜交瘤細胞技術的建立使得針對特定抗原，具有良好特異性和高度均一性的單克隆抗體的大規(guī)模生產(chǎn)成為可能，而在基因工程研究中涌現(xiàn)的技術突破則為抗體人源化和全序列人抗體的研究奠定了基礎，使得醫(yī)用單克隆抗體成為當今藥物研發(fā)的熱點之一。相較于小分子藥物，單克隆抗體能特異而高效地識別并結合靶點，具有藥效強，副作用小和藥物半衰期長等優(yōu)勢，在腫瘤、自身免疫性疾病、慢性炎癥反應、器官移植排斥及病毒感染等的治療中獲得廣泛應用。而在藥物研發(fā)過程中，可靠，精準且靈

2、敏的分析定量方法必不可少?，F(xiàn)有定量方法的金標準，酶聯(lián)免疫吸附測定法雖然具有操作簡便，檢測限低且通量高的長處，但也存在結果重現(xiàn)性差，線性范圍窄，復雜基質的內源性干擾等弊端。在小分子定量領域應用成熟的液質聯(lián)用法被引入到抗體等蛋白的定量操作中，并展現(xiàn)出光明的前景。
　　能夠高通量，高靈敏度地測定多肽序列，鑒定蛋白的質譜已是蛋白組學研究中不可或缺的鑒定手段，樣品處理方法的革新和加速數(shù)據(jù)處理的生物信息學軟件的涌現(xiàn)，使得液質聯(lián)用法在定量蛋白組

3、學中同樣應用日增。但受制于現(xiàn)有蛋白分離方法和質譜檢測范圍，除少數(shù)個例，將單一目標蛋白從復雜基質中充分分離，并直接定量仍極具挑戰(zhàn)性；因此，將生物樣品蛋白酶解，通過測定酶解產(chǎn)物中指紋肽濃度來間接定量目標蛋白水平的自下而上策略，即鳥槍法，發(fā)展迅速。在絕對定量蛋白組學中，在生物基質中能夠唯一指向目標蛋白的指紋肽，含有酶解位點的指紋肽衍生物和標準蛋白都曾用于制備標準曲線，而對應的同位素標記物也用作內標以校正定量結果的偏差。但這些不同的標準曲線對生

4、物基質中同一目標蛋白定量結果的準確度的影響，以及對應的同位素內標對定量結果的偏差的校正效果，尚無系統(tǒng)性的比對研究；同時，鳥槍法用于定量蛋白組學的基礎，即指紋肽的篩選和確證還沒有被廣泛接受的標準和流程。
　　針對定量蛋白組學中自下而上的鳥槍法的上述不足，在本論文的工作中了建立完整的目標蛋白指紋肽篩選，肽段鑒定搭建納升色譜與線性離子阱/軌道阱雜交質譜系統(tǒng)作為肽段鑒定平臺。目標蛋白經(jīng)牛胰蛋白酶水解后，經(jīng)納升色譜分離通過納升噴霧即Nano

5、ESI進入雜交質譜系統(tǒng)，獲得線性離子阱質譜和高分辨的靜止軌道阱質譜聯(lián)動分析，通過搜索數(shù)據(jù)庫列出質譜檢測到的所有肽段，并確定其在特定生物基質中的候選指紋肽列表；使用低流速色譜與三重四級桿質譜系統(tǒng)建立蛋白定量平臺評估候選指紋肽，通過在線正交試驗設計優(yōu)化候選指紋肽的SRM參數(shù)并評估其穩(wěn)定性，比較不同候選指紋肽的靈敏度，以得到最佳指紋肽及其最優(yōu)SRM參數(shù)用于定量。此二平臺被成功用于anti-HCV單抗的指紋肽篩選和最佳指紋肽SRM參數(shù)的優(yōu)化，并