基于免疫親合分離技術的人血漿蛋白質組研究.pdf

1、人血液含有來源于幾乎所有細胞、組織、器官的蛋白質，可以直接反映病理、生理狀態(tài)，是各種疾病診斷、生物標志物發(fā)現(xiàn)的最有價值的標本。因此，血漿蛋白質組成為人們研究的熱點。而血漿蛋白質又具有獨特的性質(蛋白質組成、功能及結構形式極端復雜)，高低豐度蛋白質含量的動態(tài)范圍可差1012之巨，限制了質譜對低豐度蛋白的有效檢測，對血漿蛋白質組學的研究技術體系提出了挑戰(zhàn)。因此，如何去除血漿中高豐度蛋白質從而使低豐度蛋白質得以富集(降低高豐度蛋白質對低豐度蛋

2、白質鑒定的干擾)，成為血漿蛋白質鑒定的關鍵和研究熱點。目前基于免疫親合去除血漿高豐度蛋白質的技術得到研究者普遍認可和廣泛的應用，但由于血漿中幾種高豐度蛋白質是轉運蛋白質或結合蛋白，高豐度蛋白質的去除可能會造成其他蛋白質的損失，這是血漿蛋白質組表達譜和差異蛋白質組研究者普遍關注的問題，也是本課題研究的主要內容；另外，對免疫親合系統(tǒng)處理樣本時造成蛋白質非特異丟失的原因進行了考察與分析；基于兩種免疫親合分離(而非免疫親合去除)技術的血漿蛋白質

3、組研究，使更大范圍的血漿蛋白質鑒定得以實現(xiàn)，為今后大規(guī)模血漿蛋白質組研究提供新的思路。 在本研究中，用目前廣泛應用的可同時去除六種高豐度蛋白質的免疫親合色譜柱(AgilentMARS)和剛剛發(fā)展的同時去除十二種高豐度蛋白質的免疫親合色譜柱(GenwaySepproTMMIXEDl2)分離人血漿樣本，分別得到與親合柱結合的組分(MARS-BF和SepproTM-BF)和流出組分(MARS-FF和SepproTM-FF)。這四個蛋白

4、質組分別經(jīng)胰蛋白酶酶切后得到復雜肽混合物，采取離線陽離子交換色譜分離及反相色譜離子阱串聯(lián)質譜鑒定的技術體系，分別對肽混合物進行分離鑒定。采用國際人類蛋白質組組織血漿蛋白質組項目(HUPOPPP)推薦的過濾參數(shù)，共鑒定蛋白質2401種，屬于較大的血漿蛋白質組數(shù)據(jù)集。當采用更嚴格的過濾參數(shù)，四個組分共鑒定蛋白質529種，其中277種蛋白質是HUPOPPP鑒定的889種中沒有覆蓋的。鑒定蛋白質的動態(tài)范圍為9個數(shù)量級。采用搜索反轉數(shù)據(jù)庫的方法評

5、價數(shù)據(jù)可靠性，結果表明肽段鑒定的可靠性從73．6％上升到99％。為了確定結合組分中大量的非靶蛋白質的存在是否是由于其和高豐度蛋白質的相互作用造成的，對白蛋白做了免疫共沉淀實驗，并對其結合蛋白質進行了質譜鑒定和分析。得到40種可能與白蛋白相互作用的蛋白質，其中24種蛋白質與結合組分是重疊的。 免疫親合色譜處理血漿蛋白質后，高豐度蛋白的去除降低了其對低豐度蛋白的干擾，從而有利于中、低豐度蛋白質的鑒定。這是血漿蛋白質成分分析鑒定的重要

6、步驟。從兩種免疫親合分離得到的結合組分來看，高豐度蛋白質的去除會造成其他蛋白質也隨著被去除。免疫親合技術的有效性和特異性方面有待于進一步優(yōu)化?；谑N高豐度蛋白質的免疫親合分離與六種高豐度蛋白質的免疫親合分離相比，并沒有鑒定更多的低豐度蛋白質。在高可信度鑒定的529種蛋白質中，有129種蛋白質只存在于結合組分中，血漿免疫親合處理得到的流出組分和結合組分都進行鑒定，必然會形成互補，使血漿蛋白質組的研究得以補充。與HUPOPPPl8個實驗